擇時針刺足三里穴對炎性痛癥大鼠不同部位TRPV1的影響＊

白艾靈，劉 祎，韋 婷，趙征宇，蔡定均

（成都中醫藥大學針灸推拿學院 成都 610075）

近年研究顯示，TRPV1已然成為研究疼痛離子通道熱點，而TRPV1（香草酸瞬時受體亞型1）能夠在機體中感受熱、酸以及內源性炎癥因子等多種刺激，是炎性疼痛和機械性刺激的重要因子。眾所周知，TRPV1是外周感覺神經元的傷害感受器，在急性和慢性炎癥疼痛中皆具有重要地位，其可識別來自周圍神經末梢的感覺輸入，包括疼痛信號，隨著TRPV1通道的激活從而誘導陽離子流入，并進一步激活信號傳導途徑[1-3]。有研究發現，背根神經節含有初級感覺神經元，負責接收對有害刺激反應的疼痛信號，并將信號傳遞給脊髓背角，在疼痛信號的整合、傳導和外周敏化中發揮重要作用，如有研究表明，表達TRPV1的背根神經元，在通過疼痛、炎癥等刺激而引發的信號轉移中發揮關鍵作用[4-5]。

TRPV1 是感覺痛覺受體的重要信號整合因子，能夠誘導敏化疼痛，若針刺干預則可通過一系列的應答反應來達到鎮痛的目的[5-6]。大量研究證實，針灸具有顯著的鎮痛效果，且針刺鎮痛呈現出明顯的節律性[7-8]。背根神經節（代稱DRG）和脊髓皆作為感覺傳入神經元，其與針刺鎮痛具有密切相關性[9]。針刺能緩解炎性疼痛，但由于針刺手法、穴位的選取和時間點不同，針刺對炎性動物的鎮痛效果均不同。足三里穴在針刺鎮痛研究中運用較為廣泛，對炎癥疼痛亦具有明顯效應[10]。

本課題前期研究發現，以正常動物及弗氏炎癥痛癥等實驗模型為載體，針灸的時辰差異可決定其抑制疼痛的療效的不同，然而此間差異的機制如何，且該機制是否與TRPV1通道相關尚不清楚，故而該研究于前期實驗的條件下，起于弗氏佐劑模型，并以TRPV1的表達作為效應指標，選取針刺鎮痛效應的痛閾變化最優與最差兩個點[11]，研究選擇不一樣的時間點針刺足三里穴對弗氏炎癥痛癥大鼠中多個層次中TRPV1表達情況，去探索不同時間點針刺鎮痛效應差異機制與TRPV1不同部位的蛋白表達的相關性。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性SD 大鼠（Wt：（160-230）g，四川省動物科研中心提供，SCXK（川）2013-15）。在成都中醫藥大學時間節律室內飼養，并使用CLOCKLAB 自動調控光照時間（早上七點開始光照，晚上七點關閉光照），通風1 h/1次，室溫：（21±2）℃。

1.2 實驗試劑

弗氏完全佐劑（以下簡稱CFA，F5881-10ML，101M8711，Sigma-Aldrich生物技術有限公司）；生理鹽水；TRPV1，兔多克隆抗體（ab63083，abcam 艾博抗貿易有限公司）。

2 方法

2.1 模型制備與實驗分組

將所有實驗大鼠于自動光暗周期馴養7 天后，采用輻射熱甩尾法，先進行痛閾測定并篩選出實驗對象，痛閾篩選標準為3-10 s 成功甩尾者即納入為實驗大鼠。然后再按照痛閾值隨機分為待模型復制組（模型組）和生理鹽水組（空白組）。模型組以1 ml 醫用注射器在實驗對象右足足底皮下注射0.1 ml CFA，空白組以同樣手段在實驗對象右足足墊部皮內注射等量生理鹽水；24 小時后，觀察大鼠右足情況以及其行為從而判斷造模是否成果。將成功獲得的模型實驗鼠，依據其痛閾數值隨機分為兩個實驗組，即模型組、模型針刺組（以下簡稱：模針組），每組按照不同時間點分別處理，又分為ZT8（15:00）、ZT16（23:00）兩個時間組。

2.2 處理方式

模針組：于注射CFA 第二日分別在兩個時間點，即ZT8 和ZT16，給予針刺，選穴足三里穴，共針刺25-35 min，每五分鐘持續捻轉手法行針1 分鐘（頻率：110-130 次/分鐘），即每次針刺共行針5 次，而針刺處理時，需提前使用自制綁鼠工具捆綁老鼠，1日1次，連續治療7日。

模型組、空白組的實驗大鼠僅進行與模針組實驗大鼠以相同自制固定器具并同樣方式捆綁固定30 分鐘處理。

2.3 檢測指標

將從大鼠穴區皮膚、脊髓和DRG 中采集的組織樣本運用免疫組化的方式測定目標物的表達情況，而免疫組織化學測定結果顯示標志：陽性表達物、陰性表達和底色分別標記于不同的顏色即為淺黃色或棕黃色、藍色、白色。使用Media Cybernetics 公司的Image-ProPlus 6.0圖像分析檢測采集的圖像并確定其平均光密度。

2.5 統計方法

應用SPSS19.0 統計分析軟件對所得實驗數據以單因素方差統計方法分析，結果皆以平均數±標準差(xˉ±S)表示，以P＜0.05認為差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 ZT8時間點針刺調節大鼠不同層次中TRPV1的變化情況

ZT8時間點：①在穴區皮膚中，模型組大鼠皮膚樣本中TRPV1的含量明顯高于空白組大鼠中TRPV1的含量(P＜0.05),而模針組可能由于針刺調節的影響其皮膚樣本中TRPV1的表達明顯低于模型組(P＜0.05)。②大鼠脊髓中,模型組中脊髓節段樣本中TRPV1的含量明顯多于空白組(P＜0.05)；模針組脊髓樣本組織中相較于模型組脊髓節段樣本中TRPV1的表達明顯下調了

表1 ZT8時針刺調節大鼠多個層次中TRPV1變化情況（± S；n=9）

表1 ZT8時針刺調節大鼠多個層次中TRPV1變化情況（± S；n=9）

注：與模型組相比，△P ＜0.05 △△P ＜0.01

背根神經節TRPV1 0.1523±0.0060△△0.1792±0.0093 0.1581±0.0060△△組別空白組模型組模針組皮膚中TRPV1 0.1729±0.0112△0.1877±0.0092 0.1729±0.0121△脊髓TRPV1 0.1401±0.0108△△0.1614±0.0106 0.1425±0.0111△△

表2 ZT16時針刺對大鼠各個層面組織中TRPV1調節情況（± S；n=9）

表2 ZT16時針刺對大鼠各個層面組織中TRPV1調節情況（± S；n=9）

注：與模型組相比，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

背根神經節TRPV1 0.1546±0.0051△△0.1735±0.0053 0.1657±0.0062△組別空白組模型組模針組皮膚中TRPV1 0.1735±0.0094△0.1856±0.0069 0.1760±0.0094△脊髓TRPV1 0.1405±0.0057△△0.1504±0.0074 0.1428±0.0060△

TRPV1的表達量(P＜0.05)。③在DRG 組織中，模型組DRG 中目標因子與空白組DRG 樣本中TRPV1的增加量具有顯著差異（P＜0.01）；模針組DRG 樣本組織則比模型組DRG 中TRPV1表達量下調許多（P＜0.05）。（見表1、圖1、圖2）

3.2 ZT16 時間點針刺調節大鼠各個部位中TPRV1表達的情況

ZT16 時間點：①穴區皮膚中，模型組與空白組比較，模型組大鼠皮膚樣本組織中TRPV1的含量明顯增加(P＜0.05)；模針組中大鼠皮膚TRPV1比模型組下調得更明顯（P＜0.05）②根據結果顯示：在脊髓組織中，模型組大鼠脊髓節段樣本中TRPV1的含量多于空白組（P＜0.01）；經過針刺處理后，即模針組大鼠脊髓節段中TRPV1的表達量明顯減少（P＜0.05）。③在DRG 組織TPRV1三個實驗組中的變化情況與脊髓中TRPV1的表達情況類似，即模針組DRG 樣本中目標物TRPV1的含量亦明顯減少（P＜0.05）。（見表2、圖3、圖4）

4 討論

近年文獻研究顯示，針灸治療痛癥已經成為至關重要的手段之一。有研究發現，人類對于疼痛的感受亦具有一定的時間規律，但不同的病癥表現出來的疼痛的閾值以及閾值最高值的時間亦具有差異性，如膽絞痛、偏頭痛等疼痛閾值最高時大多發生于夜晚，然而某些關節炎性疼痛等疼痛閾值最高時間，大多亦可能發生于凌晨抑或是上午時段。有研究表明，于整個白晝與黑夜時段，晚上疼痛發作的次數較多，特別是上半夜甚至是整個晝夜的頻發時段[12-13]。以上研究皆顯示出痛癥其本身即具有一定的節律，而且各種痛癥所表現出來的節律還存在一定的差異性。

圖1 ZT8時間點大鼠局部皮膚、脊髓及背根神經節TRPV1的表達(IHC 100×)

圖2 ZT8時間點大鼠局部皮膚、脊髓及DRG中TRPV1的表達（IHC 200/400×）

圖3 ZT16時間點大鼠局部皮膚、脊髓及DRG中TRPV1的表達(IHC 100×)

圖4 ZT16時間點大鼠局部皮膚、脊髓及DRG中TRPV1的變化情況（IHC 200/400×）

相應地，在近年來的各種研究皆已經驗證了時間子午流注法等中醫傳統的時間針灸療法對于疼痛的治療的明確效應，例如，有研究發現，采用時刻注穴法治療疾病，結果顯示其與對照組相比療效具有統計學意義，且疼痛癥狀亦有明顯改善[14]。現代基礎研究亦提示了不同時間針刺在針刺鎮痛中的重要地位，例如，在不同的間隔時間對佐劑性關節炎的大鼠進行針刺，針刺對于疼痛的效應具有明顯的不同性，于間隔時間的不同進行針刺，結果顯示在整個晝夜后針刺抑制炎癥大鼠疼痛的療效具有顯著的提升，因此本研究提出針刺的時間跨距的差異所產生的抑制疼痛的效應的差異性，有可能與阿片肽基因密切相關[15]。有相關研究選用不同時間電針針刺，以此來觀察外傷疼痛模型實驗大鼠血漿褪黑素的濃度，在不同時間點針刺，結果顯示正常大鼠血漿褪黑素濃度具有顯著節律性,模針組治療后血漿褪黑素濃度與模型組相比較，該濃度有一定的增加；而其節律性則和空白組類似，表明針刺可能會影響大鼠松果體分泌的褪黑素，且與外傷疼痛所引起的褪黑素節律紊亂的恢復具有密切關系[16]。因此針刺抑制疼痛的療效確切，且具有一定的節律性。

疼痛具有保護作用，但其失調會對個人的生活產生負面影響，炎癥性疼痛可由神經系統傷害感受器引起，且炎性化疼痛通常會引起神經纖維周圍化學環境的高敏性。據研究顯示，引發的炎性疼痛，通過動作電位、通道、受體和信號分子向上游傳導至脊柱或皮質腦區，從而引起一系列的疼痛反應；炎性疼痛抑或由外周組織損傷或炎癥引起，增加質子、組胺、三磷酸腺苷等的釋放，這些物質的過度表達進一步導致外周和中樞致敏則引發疼痛[17-19]。疼痛的傷害感受器廣泛分布于機體的各個組織，TRPV1作為對傷害性刺激有反應的重要通道，其在皮膚細胞中表達并充當疼痛或信號傳感器；在炎癥局部皮膚中釋放的介質可能有助于外周致敏，特別是通過TRPV1致敏，從而促進疼痛的發生[20]。在脊髓及背根神經節的痛覺神經末梢和背角淺層均分布有TRPV1，其神經元感知外界有害刺激并傳遞信息到脊髓背角和三叉神經脊束核，從而在炎癥痛癥和神經源性痛癥中起著至為關鍵作用[21]。總之，炎癥疼痛通過各種信號通路來調節TRPV1的活性，以使得TRPV1的激活從而促進痛覺過敏的產生和維持。

有研究顯示，針刺作為一種物理刺激，針刺刺激后可通過相應的神經傳入中樞神經系統，引起不同的反應。脊髓為中樞神經系統的一部分，作為感覺傳導的神經元，其在針刺鎮痛的過程中起著不可或缺的作用[9,13]。背根神經節含有初級感覺神經元，負責接受對有害刺激反應的疼痛信號，從外周神經元傳遞的信號刺激脊髓傷害感受神經元，最后導致中樞敏化，其在這一過程中扮演著極為關鍵的角色[22]。研究者發現，在炎性疼痛過程中，TPRV1可以被P 物質等激活，再被PKC 磷酸化，然而電針針刺足三里穴可以通過影響某些物質的變化，從而達到抑制疼痛的目的23-24]。電針雙側足三里后，DRG 和脊髓中TRPV1水平皆顯著減少，這表明針刺可以通過下調其TRPV1的過度表達或增加過多，來達到舒緩炎性痛癥的目的。背根神經節中TRPV1水平亦與炎性疼痛的表達密切相關，以皮下注射完全弗氏佐劑來建立炎性疼痛模型，結果觀察到在注射弗氏佐劑后第6天DRG中TPRV1的含量顯著增加，然而電針后可以觀察到其表達顯著下調[25-26]。足三里穴區皮膚由脊髓神經節段所發出的神經支配，刺激足三里穴可以通過一定通路影響到脊髓背角的反應機制[27]。因此，針刺鎮痛的機制不僅僅涉及單獨的神經結構，而表明鎮痛效應是由多層次、多水平的綜合整合來反應的。

相應地，TRPV1是機械性刺激和熱刺激的感受器，是研究疼痛機制中的特異性靶點，同時其與疼痛傳導過程關系密切；有研究顯示脊髓背角TRPV1表達的增加對初級中樞的功能具有致敏性[4,18,28]。有研究發現TRPV1和時鐘基因Cry2 之間具有密切的關系，不僅如此，TRPV1的晝夜節律表達模式與晝夜節律系統之間具有緊密的相互作用[29-30]。該實驗顯示在ZT8 與ZT16時，炎性痛癥大鼠中穴區皮膚、脊髓和DRG 中TRPV1的表達量皆明顯增加或顯著上調，表明炎性痛癥可能誘發皮膚、脊髓和DRG 中TRPV1的上調；且其兩個時間點大鼠穴區皮膚、脊髓和背根神經節中TRPV1的蛋白含量具有明顯差異，而針刺足三里穴在ZT8、ZT16均顯示此各個組織中目標因子TRPV1的表達明顯下降，此亦進一步證明了針刺鎮痛效應機制的復雜性、多樣性，其不僅僅局限于某一區域，而是從外周到中樞的多層次、多水平的綜合整合從而達到針刺鎮痛的作用。

不僅如此，在ZT8、ZT16 針刺治療炎性痛癥大鼠時，大鼠痛閾均顯示升高，但是其痛閾升高程度卻具有明顯差異性，而且其痛閾變化值在ZT8、ZT16 分別呈現出最優、最差兩個方面，這也提示針刺時間不同，針刺鎮痛效應具有一定的差異性亦可能與不同時間點各區域TRPV1 的蛋白含量差異相關。由上敘述可知，TRPV1與時間鐘基因具有密切聯系，其可能成為調控時鐘基因的新參與者，因此，不同時間點出現的針刺鎮痛效應的差異性可能與TRPV1本身晝夜節律的表達模式相關，但是其具體如何調控則并不清楚；而該實驗從多個層面進行分析研究了不同時間點針刺鎮痛效應差異與不同部位TRPV1表達的相關性，同時為臨床針灸鎮痛效應提供了非常有力的理論依據，因針對TRPV1可能的上下游信號分子機制亦未有清晰的研究分析，亦為后續研究或我團隊亦正在針對該問題進行下一步的研究奠定了夯實的科學基礎。