真武湯治療腎纖維化的藥效物質基礎及分子作用機制研究＊

張怡萍，王 倩，肖 雪，嚴詩楷，鄧遠輝＊＊，李莎莎＊＊

（1. 廣州中醫藥大學第二臨床醫學院 廣州 510006；2. 廣東藥科大學中醫藥研究院 廣州 510006；3. 上海交通大學藥學院 上海 200240）

腎臟纖維化是腎臟在一系列致病因子的刺激下由腎臟固有細胞受損發展成為功能逐步喪失的漸進過程，腎間質纖維化、腎小球萎縮及腎小管硬化為腎纖維化主要的病理特征[1]。由于腎纖維化為各種慢性腎臟疾病（Chronic Kidney Disease, CKD）最終進展為腎功能障礙甚至尿毒癥的共同病理演變途徑，因此在慢性腎臟病的發病過程中，腎纖維化是不容忽視的一個重要病理過程。目前研究表明腎纖維化發病過程復雜且與諸多因素有關，涉及到炎癥因子調控（促纖維化因子、抑纖維化因子）、細胞外基質（ECM）合成及積累、氧化應激等多個環節[2-4]，臨床上腎纖維化疾病尚無法治愈，因此有必要對腎纖維化的發病機制進行深入探究以期為該病的臨床診斷及治療提供新的思路。

真武湯出自于《傷寒論》中的經典名方，由生姜、炮附子、茯苓、白芍、白術五味藥組成，具有溫陽利水的功效[5]。臨床上真武湯加減常用于治療腎臟相關的各種疾病中，如糖尿病腎病、慢性腎小球腎炎、腎病綜合征、急性腎衰竭等，患者經真武湯治療后其臨床癥狀、免疫功能得到明顯的改善，且藥物的安全性高[6]。課題組前期藥理實驗表明真武湯有明顯改善腎纖維化、延緩病情發展的功能[7-9]，但由于藥味組成復雜，化學成分較多，對于真武湯治療腎纖維化的活性成分及潛在作用機制還需進一步深入探索。

網絡藥理學是基于系統生物學理論，主要以文獻為基礎，同時結合多種組學、高通量數據分析、網絡分析及虛擬計算等技術，通過構建“藥物-成分-疾病-靶點”之間復雜的網絡關系，闡明疾病的發生發展過程、藥物藥效物質基礎及作用機制。由于網絡藥理學具有系統性及整體性的特點，與中藥及其組方制劑的多成分、多靶點、多途徑、多層次的作用特點相似，在防治復雜疾病方面具有獨特的優勢[10]。因此本文主要通過網絡藥理學的方法分析真武湯的藥效活性成分及潛在作用靶點，深入闡明真武湯治療腎纖維化的分子機制。

1 材料與方法

1.1 真武湯活性成分的篩選

采用中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http//lsp.nwu.edu.cn./tcmsp.php）對真武湯各單味藥附子（Aconiti Lateralis Radix Praeparata）、茯苓（Poria Cocos Wolf）、生 姜（Zingiber Officinale Roscoe）、白 術（Atractylodes Macrocephala Koidz）、白 芍（Paeoniae Radix Alba）進行檢索，獲得真武湯的主要化學成分，以成分的口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）作為篩選條件對各味藥的化學成分進行篩選，選取OB ＞30%和DL ＞0.18 的成分為真武湯治療腎纖維化的主要活性成分。

1.2 藥效成分靶點預測

采用TCMSP 數據庫獲得篩選后藥效成分的靶蛋白，將篩選得到的靶蛋白英文名輸入到蛋白質數據庫（uniprot）中，收集對應的靶點基因；同時利用pubmed數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）獲得真武湯活性成分相應的典型SMILES 結構，將獲得的SMILES 結構導 入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數據庫中，利用平臺反向藥效團匹配方法得到虛擬篩選結果，收集相關靶點基因，將上述兩種方式合并去除重復靶點建立藥效活性成分靶標庫。

1.3 腎纖維化靶點的篩選

利用GeneCards（https://www.genecards.org/）數據庫，以腎纖維化（renal fibrosis）為關鍵詞進行搜索，得到與腎纖維化相關的基因，作為疾病的候選靶點基因。

1.4 網絡的構建

將上述真武湯藥效成分、成分作用的靶點及疾病作用靶點的PPI 網絡導入Cytoscape 3.5.0 軟件進行可視化分析，結果共得到四個網絡：“活性成分-作用靶點”網絡、“活性成分-疾病共有靶點PPI”網絡、“成分-疾病-靶點-通路”網絡、“核心成分-疾病-核心靶點-通路”網絡，活性成分、作用靶點及潛在作用通路用不同顏色的節點（node）表示。若某一靶點為某化合物的潛在作用靶點，則以邊（edge）相連，通過構建網絡研究真武湯治療腎纖維化多成分、多靶點、多通路的作用。

1.5 靶點通路注釋分析

取活性成分靶標與疾病靶標的交集基因，利用軟件中的clugo 插件對獲取的靶點信息進行基因本體論信息資源數據庫（GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，通過設定閾值P＜0.01 選取具有顯著性差異的所有通路，篩選靠前的幾條通路通過KEGG（https://www.kegg.jp/）數據庫進行整合并繪制最終的通路圖。

2 結果

2.1 真武湯藥效成分篩選

本研究利用TCMSP 數據庫根據口服生物利用度和類藥性作為篩選標準共得到真武湯候選藥效成分61 種，其中附子21 種，茯苓15 種，白芍13 種，白術7種，生姜5 種，經剔除未篩查到靶點的成分，最終獲得藥效成分43 種，其中β-谷甾醇是附子和白芍的共有成分，表1為成分篩選后的結果。

2.2 真武湯化學成分靶點預測

在TCMSP 數據庫中篩查藥效成分及藥效成分的靶蛋白，將篩選得到的靶蛋白英文名輸入到Uniprot數據庫中，得到成分靶點基因；另外將TCMSP 數據庫中篩查到的藥效成分采用Pubchem 數據庫搜索SMILES號，在Swiss Target Prediction 中輸入SMILES 號，物種選擇“Homo sapiens”，找到相應的靶點基因。將這兩種方法篩選到的成分取并集，刪除兩者共同的成分靶點，篩選出257個藥效成分的靶點，得到成分靶點關系767對。

2.3 活性成分-腎纖維化共有靶點的篩選

以“renal fibrosis”為關鍵詞在GeneCards 數據庫中進行檢索，結果得到與腎纖維化相關的靶點基因3995個，選取Score 值前1000 個基因導入https://string-db.org/網站中，得到腎纖維化靶點PPI 網絡圖，將腎纖維化靶點的相互作用網絡導入Cytoscap 3.5.0 中，在Cytoscap 3.5.0 中將活性成分-作用靶點網絡和腎纖維

化靶點的相互作用網絡利用merge 功能進行合并，得到66個活性成分與疾病的共有靶點。

表1 真武湯藥效成分篩選結果

2.4 網絡構建結果

2.4.1 真武湯活性成分-作用靶點網絡構建

利用Cytoscape 3.5.0 軟件構建真武湯“活性成分-作用靶點”網絡如圖1-A 所示。該網絡共包含300 個節點，766 條邊，其中藥效成分有43 個節點，與藥效成分相關的靶點基因有257個節點。

2.4.2 活性成分-疾病共有靶點PPI網絡構建

采用Cytoscape 3.5.0軟件對66個與腎纖維化相關的靶點基因進行網絡構建可視化分析。如圖1-B 所示，活性成分-疾病共有靶點PPI 網絡圖總共包括65個節點，546 條邊（其中1 個節點與其他節點無相互作用關系）。

2.4.3 成分-疾病-靶點-通路相互作用網絡

將獲得到的66 個與腎纖維化相關聯的潛在作用靶點，利用Cytoscap 3.5.0 中的Cluego 插件對靶點基因生物學過程及代謝通路進行富集分析。設置P＜0.01表示具有非常顯著性差異的代謝通路，結果得到真武湯活性成分43 個，共同的靶點66 個，參與的關鍵通路19 條，如圖1-C 所示。在網絡圖中，每個節點的大小和其Degree（度）值大小相關，節點越大顏色越深代表該節點在網絡中起關鍵作用。在“成分-疾病-靶點-通路”網絡圖中有23個靶點未富集到相關的腎纖維化代謝通路，在圖中采用白色圓圈顯示，處于網絡中心的靶點蛋白TNF、AKT1、MAPK8 為參與通路數量大于10 的三個靶蛋白，其他疾病靶點根據靶點的Degree 值是否大于所有靶點的平均值則用不同大小呈現。

2.4.4 核心成分-疾病-核心靶點-通路相互作用網絡

以能夠聚集到通路的43 個靶點為核心靶點，剔除無核心靶點的成分，結果33 個核心成分能夠作用于43 個核心靶點，參與的關鍵通路19 條，如圖1-D 所示。以Degree 值大于所有靶點平均值的靶點為關鍵核 心 靶點，TNF、AKT1、MAPK8、IL6、CASP3、JUN、

BCL2、TGFB1、PRKCB、BAX、CASP8、INSR、PTGS2、ICAM1、SELE、VCAM1、NOS3、STAT1 等18 個靶點位于網絡中心，為真武湯治療腎纖維化的重要靶點。33 個核心成分作用的關鍵靶點及關鍵核心靶點，如表2 所示。

2.5 真武湯治療腎纖維化活性成分潛在靶點的通路注釋

在GO 功能富集分析過程中，共確定了101 個GO條目，其中有10 條關于分子功能，主要涉及類固醇激素受體活性、胰島素受體結合、過氧化物酶的活性、氧化還原酶的活性、ATP 酶的活性等方面；91 條關于生物學過程，主要涉及活性氧（ROS）代謝過程的調控、白細胞介素-6（IL-6）產生的調控、氧化應激反應的調控、血管內皮生長因子（VEGF）產生的調控、一氧化氮（NO）生物合成的調控等方面。

在KEGG 通路富集分析中，共得到19 條相關通路。將通路按照P 值從小到大進行排序，得到真武湯治療腎纖維化的潛在通路，如表3 所示，其中AGERAGE 信 號 通 路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、胰島素抵抗信號通路（Insulin resistance）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路（Fluid shear stress and atherosclerosis）、Toxoplasmosis信號通路、乙型肝炎信號通路（Hepatitis B）、非酒精性脂肪肝信號通路（Non-alcoholic fatty liver disease）為真武湯治療腎纖維化的重要信號通路。

2.6 真武湯治療腎纖維化通路分析

將治療腎纖維化的關鍵核心靶點與前三條通路通過KEGG 數據庫進行通路注釋分析，并進行整合繪制最終的通路圖（如圖2）。通路中的靶點為藍色長方形標記，真武湯治療腎纖維化的靶點為紫色橢圓標記，由圖中可以看出AGE-RAGE信號通路為主要的信號通路，該通路與多個通路相關，并且多個靶點直接/間接地通過該通路發揮治療腎纖維化的作用，同時

Insulin resistance signaling pathway、TNF signaling pathway、 PI3K-AKT signaling pathway、 TGF- β signaling pathway 及其他信號通路共同參與腎纖維化的過程，為真武湯治療腎纖維化的重要信號通路。

3 討論

3.1 真武湯核心成分-關鍵核心靶點探討

圖1 網絡互作圖

由表2可知山奈酚、β-谷甾醇、得爾妥因、豆甾醇、兒茶素、芍藥吉酮、茯苓酸、水黃皮素、3β-乙酰氧基蒼術酮、麥角甾醇過氧化物、6-甲基姜二醇雙乙酸、芍藥苷等活性成分均可作用于關鍵核心靶點，其中山奈酚、β-谷甾醇對應的關鍵核心靶點最多，分別為13 個和6個。山奈酚為白芍中的黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[11]，有研究表明在糖尿病腎病大鼠中，山奈酚能夠降低大鼠蛋白尿、血肌酐和尿素氮含量，同時降低caspase-3、caspase-9、NLRP3、ASC 和caspase-1 及炎癥因子IL-18 和IL-1β的表達水平，對腎功能和組織病理損傷具有保護作用[12]。β-谷甾醇為來源于白芍和附子中的三萜類成分，具有降脂、抗氧化、免疫調解等作用，Loizou 等[13]研究表明β-谷甾醇能夠抑制血管內皮細胞粘附分子1（VCAM-1）和細胞間粘附分子1（ICAM-1）表達，減弱NF-kB p65 磷酸化，提示β-谷甾醇有抗內皮細胞炎癥的作用，同時β-谷甾醇葡萄糖苷也有強的抑制TNFα、IL-1β和IL-6炎癥因子作用。芍藥苷對應的關鍵核心靶點為TNF、IL6，TNF、IL6 為腎纖維化發生關鍵炎性細胞因子，在促進細胞外基質（ECM）積聚及在加速腎小球硬化進展中起重要作用[14]，表明芍藥苷能直接參與治療腎纖維化的過程。來自茯苓中的茯苓酸和麥角甾醇過氧化物主要作用于NOS3 等疾病靶點，NOS3 為內皮性一氧化氮合酶基因，主要功能是參與精氨酸和脯氨酸代謝，并催化生成一氧化氮（NO），NO具有調節血管張力和影響內皮功能，腎組織各個部位的固有細胞均能分泌NO，腎固有細胞NO 分泌不足可引起細胞損傷及內皮功能障礙，因此NO 的釋放在維持腎臟正常生理功能中具有重要意義[15]。其他成分可作用的關鍵核心靶點較少，但都能作用于同一個疾病靶點PTGS2，PTGS2 為前列腺素內過氧化物合酶2，在外部環境的刺激下，腎固有細胞中PTGS2 的表達上調，催化花生四烯酸類物質，通過環氧酶的作用產生多種前列腺素，調節機體炎癥反應，發揮抗纖維化的作用[16]，表明真武湯的多數成分可以通過PTGS2 靶點調控腎纖維化過程。

表2 核心成分-核心靶點

由成分-關鍵靶點探討得知：白芍中的山奈酚、兒茶素、芍藥苷及茯苓中的茯苓酸和麥角甾醇過氧化物

等成分為真武湯中治療腎纖維化的主要活性成分，其中，白芍中的山奈酚、兒茶素、茯苓酸所對應的靶點TNF、AKT1、MAPK8、IL6、CASP3、JUN、TGFβ1 等均被證實與腎纖維化發展密切相關[17-21]，現代藥理研究表明白芍具有免疫抑制樣作用，而腎臟疾病多以免疫因素為驅動因素，因此白芍應用于治療腎臟疾病具有充分的理論依據，另外其他成分可通過NOS3、PTGS2 或其他靶點共同治療腎纖維化。

表3 真武湯治療腎纖維化潛在靶點的通路

圖2 KEGG通路富集分析圖

3.2 靶點GO功能分析

GO 分析結果表明，核心靶點主要涉及類固醇激素受體活性、胰島素受體活性、過氧化物酶的活性、氧化還原酶的活性、ATP 酶的活性等分子功能，涉及氧化應激反應的調控、活性氧代謝過程的調控、白細胞介素-6 產生的調控、血管內皮生長因子產生的調控、一氧化氮生物合成的調控等生物過程，提示真武湯治療腎纖維化與胰島素受體活性、能量代謝、氧化應激及調節腎纖維化相關因子表達的水平有關。西醫認為糖尿病為導致腎臟疾病的重要因素，因此糖尿病腎病患者通過注射胰島素可使腎小球肥大得到緩解，同時能減少患者尿微量白蛋白的含量，降低腎小球濾過率，改善疾病進程[1]。氧化應激會導致活性氧（ROS）的產生，在腎纖維化的發生和發展中ROS 的濃度對調節著機體細胞的增殖、分化起著至關重要的作用，前期實驗[22]表明真武湯能使腎纖維化大鼠血清中谷胱甘肽（GSH）及腎臟中ROS 的水平恢復正常，超氧化物歧化酶（T-SOD）活性增加且維持在較高水平，同時可以提高乳酸脫氫酶（LDH）、ATP 及線粒體功能相關的酶的活性，尤其是對有氧呼吸具有整體調節作用，表明真武湯可通過緩解體內氧化應激反應、增加能量代謝治療腎纖維化，進一步證實了研究結果的準確性。

3.3 KEGG通路分析

AGE-RAGE 信號通路的激活與腎纖維化發病密切相關，該通路中與腎纖維化相關的靶點數量最多有16 個并且與多條通路協同調控腎纖維化進程，廣泛參與細胞凋亡、血管生成及炎癥反應等。AGEs 為晚期糖基化終末產物，RAGE 為晚期糖基化終末產物受體，AGE 與RAGE 蛋白相互結合可以激活PI3K/Akt（磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶）信號通路，PI3K/Akt 信號通路在調節細胞功能方面起著重要作用[23]，PI3K可與其下游分子Akt結合釋放大量的炎性介質如TNF-α、IL-6、VCAM-1、ICAM-1，產生炎癥反應加速腎纖維化進程。鐘利平等[24]在研究抗纖靈方對PI3K/AKT/mTOR 信號通路的影響，發現抗纖靈方能夠改善模型小鼠24 h 尿蛋白、尿素氮、血肌酐含量，其機制與抑制PI3K/AKT/m TOR 信號通路表達相關。同時AGE與RAGE蛋白結合后可作用于細胞內的還原型輔酶Ⅱ（NADPH），在生物體的酶促反應中NADPH 可作為還原劑參與多種合成代謝反應，并起到傳遞氫體的作用，NADPH在NADPH氧化酶的作用下產生ROS，肝臟中的血管緊張素原（AGT）被ROS 裂解形成血管緊張素I（AngI），AngI 繼而被ACE 加工處理生成AngⅡ，AngⅡ在細胞質膜上都含有的G 蛋白偶聯受體—AT1R 介導下激活TGF-β信號通路，其中TGF-β1是腎纖維化的關鍵炎性因子，其促纖維化作用主要通過下游Smads 家族傳遞信號，TGF-β1 上調可通過TGF-β1/Smad 信號通路使ECM 過度積聚，從而導致腎臟纖維化的發生。

腫瘤壞死因子（TNF-α）主要由單核巨噬細胞和活化的T細胞產生的一類具有重要生物活性的炎癥細胞因子，也可由腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞產生，TNF-α與1 型 受 體（TNFR1 又 稱 作p60，p55，CD120a）在胞外區結合，使TNFR1 形成一個三聚體，三聚體的TNFR1 在細胞內聚集招募下游傳導蛋白（TRADD、TRAF2/5、RIPI），下游傳導蛋白形成LKK 激酶復合體，激活轉錄因子NF-kB，活化的NF-kB 和抑制因子IkB-β結合能夠誘導或激活TNF-α和IL-6 的產生，進一步擴大炎癥反應，激活NF-kB 通路誘導下游的CASP8 以及其他效應分子CASP3/CASP8，產生級聯激活反應，最終引起靶細胞凋亡。同時TNF 與2 型受體（TNFR2，又稱作p80，p75，CD120b）結合，通過TRAF 家族成員相關的NF-kB 激活劑介導PI3K-Akt信號通路促進腎臟纖維化發生。

腎臟是胰島素的靶器官，含有豐富的胰島素受體，包括腎小球足細胞、內皮細胞、系膜細胞、腎小管上皮細胞和集合管上皮細胞在內的腎固有細胞，均對作為效應細胞的胰島素高度敏感，這些細胞的結構和功能異常與胰島素及其受體活性密切相關[25]，胰島素抵抗是慢性腎臟病進展的機制之一，文獻報道足細胞血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在調節腎小球濾過的功能上發揮重要作用，而胰島素可調節VEGF 在腎臟中的表達，表明Insulin resistance 信號通路在為真武湯治療腎纖維化的重要通 路[26]。 其 他 信 號 通 路 如Fluid shear stress and atherosclerosis、Toxoplasmosis、Non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）等參與腎纖維化相關的靶點較多，提示其在腎纖維化的發生、發展過程可能發揮重要作用。

本研究通過網絡藥理學方法系統的對真武湯治療腎纖維化的主要成分、潛在靶點及作用機制進行研究，表明真武湯中山奈酚、β-谷甾醇、芍藥苷、茯苓酸、麥角甾醇過氧化物等成分為真武湯的主要藥效成分，其發揮抗纖維化的作用主要通過TNF、AKT1、

MAPK8、IL6、CASP3、JUN、BCL2、TGFB1、CASP8、ICAM1、NOS3 等關鍵核心靶點參與AGE-RAGE 信號通路、Insulin resistance 信號通路、TNF-α信號通路及其他相關聯的信號通路如NF-kappa B 信號通路、TGF-β信號通路通過調節胰島素受體活性、氧化應激和纖維化因子的表達水平干預疾病。本研究采用網絡藥理學的方法對真武湯治療腎纖維化的有效成分、作用靶點及相關通路進行初步探索，可為后期真武湯治療腎纖維化作用機制深入研究提供參考。盡管網絡藥理學的系統性與整體性思想與中藥的多成分、多靶點、多通路的特點殊途同歸，但尚不能完全的揭示成分-靶點-通路的作用特點，并且本研究的藥效成分是基于已有的數據庫進行預測，因此研究所得的結果還需在體內外實驗進行相關驗證。