基于網絡藥理學的茵陳五苓散治療非酒精性脂肪肝病的機制分析＊

歐海亞，葉小鵬，李 舒，劉嘉輝，鄺衛紅

（1. 廣州中醫藥大學附屬寶安中醫院 深圳 518133；2. 廣東醫科大學 湛江 524000；3. 中山大學附屬第一醫院中醫科 廣州 510080）

非酒精脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常見的慢性肝臟疾病，影響全世界約25%的成年人[1]，其特征是無大量飲酒和無其他明確的肝損害因素所致的肝實質細胞脂肪變性。近年來，中國NAFLD 患病率逐年上升，并呈現出年輕化的趨勢。有研究顯示，我國城市地區和農村地區的NAFLD患病率分別為21.83%和20.43%[2]。起初NAFLD 被認為屬于良性疾病的一種，但隨著對該病不斷深入研究發現，NAFLD 具有發展成為肝纖維化的可能性，并且與肝硬化、肝癌、肝衰竭等終末期肝病變密切相關，對公眾健康構成嚴重威脅[3-4]。目前，現代醫學對NAFLD發病機制尚不十分明確，治療措施主要以改變不良的生活習慣和控制代謝因素為主[1]，單一的治療方法難以取得理想的效果，若盲目進行多藥物干預則可能會增加肝臟的負擔。因此，尋找一種有效且作用途徑多樣化的防治方案，對治療該病以及降低NAFLD引起的肝臟終末期病變發生率具有重要的意義。而基于辯證論治，經過長期臨床驗證且具有多作用途徑優勢的中藥復方無疑值得進一步深入研究。

茵陳五苓散（Yinchenwuling Decotion，YCWLD）出自《金匱要略·黃疸病脈證并治第十五》，用于治療黃疸病（濕重于熱型），由茵陳、白術、茯苓、桂枝、澤瀉、豬苓組成，具有保肝利膽、抗炎、降血脂、改善胰島素抵抗等作用[5]，臨床研究表明，茵陳五苓散具有降低NAFLD 患者的γ-GT、ALT、ALP 及AST 等肝功能異常指標，下調LDL-C、TC 及TG，升高HDL-C 從而調節脂代謝[6]，減輕腹部CT和B超等脂肪肝影像學改變，調節腸道腸桿菌、葡萄球菌數量、擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌等腸道菌群的數量進而改善NAFLD 患者的腸道菌群紊亂狀態等功能，從多個方面發揮治療NAFLD的作用[7-8]。

然而，目前研究多局限于某一作用靶點或某一通路來論述其作用機制，無法反映本方多成分、多靶點、多途徑的特點，也未能從整體水平來闡述YCWLD 治療NAFLD 的機制。網絡藥理學結合了層次網絡構建與分析、生物信息學、計算生物學、多向藥理學分析等多學科的研究方法和內容，可以從單一靶標、單一途徑的研究形式轉變為整體、系統的形式探索藥物、靶點、疾病之間的關聯，與中醫的整體觀一致，此研究方法融合了生物網絡及計算方法與實驗方法,為研究復方物質基礎以及藥物開發提供了思路[9-10]。本研究利用網絡藥理學的方法，以中藥、化合物、疾病靶點為研究對象，對YCWLD 治療NAFLD 的物質基礎及作用機制作了較為系統的分析及預測，為系統開發YCWLD提供科學依據及研究方向。

1 材料與方法

1.1 YCWLD化學成分的收集

從TCMSP（https://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）和Batman-tcm（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）兩個中藥化學數據庫中檢索出YCWLD 中六味中藥的化學成分。通過TCMSP 數據庫對所有分子的名稱進行整理，刪除重復化合物的化合物，并獲取3D 分子結構*.mol2 格式文件。再借助OpenBabe1 2.4.1 軟件將分子結構轉換為Smiles 結構序列為后續靶點預測做準備。其中TCMSP 數據庫收集了《中華人民共和國藥典》（2010年版本）注冊500種中藥，通過文獻研究以及整合了TCM@taiwan，TCMD，TCMID 等10 多個中藥成分數據庫，從而盡可能準確及全面地獲得每味中藥中的化合物，并經過嚴格藥理學和臨床知識審查后收錄了30 069 種化合物。此外，該數據庫不僅提供了化合物信息參數查詢及化合物結構文件下載功能，而且提供了的另外一個獨特的核心功能，即通過構建多個數學模型詳細地預測了各個化合物的吸收、分布、代謝及排泄（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）等毒藥物動力學參數，為化合物地篩選提供了諸多便利，現多應用于中藥及復方的網絡藥理學研究[11]。

1.2 候選化合物的篩選

口服利用度（Oral bioavailability，OB）、類藥性（Drug-likeness，DL）兩個參數是評估化合物吸收性后送至循環系統程度及成藥可能性的重要指標，也是評估口服化合物是否可發展成為藥物的重要參數[12-13]。本次研究篩選出符合OB ≥30%、DL ≥0.20 的分子作為候選化合物，其中各個化合物的OB參數采用王永華等[14]建立的Obioavail1.1 系統進行預測，而類藥性借助谷本相似性[15]與drugbank 數據庫（http://www.drugbank.ca/）中化合物平均分子性質進行比較而獲得。

1.3 候選化合物的潛在靶標的收集

將候選化合物Smiles 分子結構序列導入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）中預測靶點，物種參數設置為Homo sapiens，以置信度閾值（Probability）評估預測結果的可靠性，并選取Probability ≥0.6的靶點作為較可靠的預測靶點。將預測靶點與TCMSP數據庫收錄的靶點取并集從而獲得化合物的潛在靶點。本次使用的Swiss Target Prediction數據庫進行靶點預測是基于分子結構與已有配體進行相似性比較，并通過交叉驗證分析從而實現靶標的準確預測[16]。而TCMSP中的靶點主要收集自DrugBank數據庫（https://www.drugbank.ca），但因仍有眾多化合物的靶點待研究，故本次研究采用數據庫收錄結合預測模式來篩選候選化合物靶點。

1.4 NALFD相關治療靶點的選擇以及靶點信息查詢

以“non-alcoholic fatty liver disease”為關鍵詞在Genecards 數據庫（http://www.genecards.org/）、Therapeutic Target Database（TTD）數據庫（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、CooLGeN 數 據 庫（http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/）查找NALFD 的作用靶點。為減少所選靶點假陽性概率，本次研究從三個數據庫中選取與疾病相關度（Relevance score）前100 的靶點作為疾病靶點。將疾病靶點與候選化合物潛在靶點取交集，從而獲得YCWLD 治療NALFD 的靶點。通過蛋白信息數據庫（universal protein knowledgebase，Uniprot）（www.Uniprot.org）將所有的治療靶標名稱轉換成genesymbol，同時利用DisGeNET 數據庫（www.disgenet.org/）分析潛在治療靶點蛋白類型。

1.5 構建草藥-候選化合物-作用靶點網絡以及蛋白互作網絡（protein-protein interaction，PPI）

采用cytoscape3.7.1 軟件分別構建草藥-候選化合物網絡、候選化合物-作用靶點網絡，然后利用軟件中merge 功能模塊將兩個網絡進行合并成，從而構建草藥-候選化合物-治療靶點網絡。將治療靶點的gene symbol導入至string（https://string-db.org）數據庫中，設置物種參數為人類從而獲得PPI 網絡。利用cytoscape中的NetworkAnalyzer 功能計算出各個節點（node）的網絡拓撲參數初步評估其重要性。上述兩個網絡中節點由中藥、化合物、靶點構成，網絡拓撲參數中的度值（degree）則表示節點連接其他節點的數量，度值越大在網絡中調控的樞紐性作用越強，重要性越突出。

1.6 靶點生物功能的注釋分析

通過生物學信息注釋數據庫DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）對PPI 網絡中的治療靶點進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析以及基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，從而探討治療靶點參與的生物學功能以及靶點涉及的信號通路，并通過R3.4.1 軟件可視化以及對kegg 結果中重要通路進行分析。DAVID 可通過將輸入的蛋白或基因列表進行與已有蛋白或基因生物學功能注釋相關聯，并通過P值評估蛋白列表注釋功能的顯著性。

2 結果與分析

2.1 YCWLD的候選化學成分

從TCMSP、Batman-tcm 兩個數據中檢索出YCWLD 化合物分別為439、136 個,刪除重復值后，篩選出符合OB ≥30%及DL ≥0.20 的候選化合物共57個，其中茵陳、茯苓、澤瀉、豬苓、桂枝、白術分別含有化合物13 個、16 個、9 個、11 個、7 個，豬苓與茯苓有相同化合物2 個，桂枝與茵陳、桂枝與澤瀉、桂枝與豬苓各有1個相同化合物，各候選化合物信息詳見表1。

2.2 YCWLD治療NALFD的潛在作用靶點

通過TCMSP 數據庫中及Swiss Target Prediction 數據庫中分別收集到YCWLD 靶點132 個、186 個，去掉重復值后共收集到286 個靶點。其中茵陳219 個、白術31個、豬苓37個、茯苓64個、桂枝86個，澤瀉33個。通過Genecard、CooLGeN、TTD 數據庫分別獲取1 162靶點，467個靶點，3個靶點，合并三個數據庫與疾病關系度（Relevance score）前100 的靶點，共得到疾病靶點317 個；將候選化合物潛在靶點與疾病靶點進行匹配，最終獲得34個YCWLD 治療NALFD 的靶點，各治療靶點詳見表2。

2.3 中藥-候選成分-作用靶點網絡的構建與分析

根據上述研究結果，借助cytoscape3.7.1 軟件將6味中藥、57個候選成分及34個潛在作用靶點進行關聯并構建中藥-候選成分-治療靶點網絡圖（圖1）。結果表明，57 個候選化合物中可作用于治療靶點的有24個，可初步認為YCWLD 中治療NALFD 的有效成分，其他33 個候選化合物與作用靶點匹配得分較低或暫未發現有治療NAFLD功能。中藥中茵陳、茯苓、豬苓、白術、桂枝、澤瀉分別含有有效成分13 個、6 個、4 個、2個、2 個、3 個，作用于32、3、2、5、7、4 個靶點，可見茵陳對YCWLD 治療NAFLD 起到了重要作用；化合物中第6 號化合物（quercetin）、19 號化合物（beta-sitosterol）、20 號化合物（sitosterol）連接治療靶點數目排前三，分別連接28、7、4 個靶點，可能成為YCWLD 治療NAFLD的主要活性成分。就靶點而言，DPP4、NR1H3、NR1H2、SREBF1、SREBF2 的度值排前五，分別連接13、9、9、3、3 個化合物，這些靶點可被多個活性成分刺激是YCWLD 治療NAFLD 主要作用靶點。從圖1可看出，草藥、化合物、靶點之間構成了復雜關系網絡，一種化合物對應多種靶點，一種靶點可以受到多種化合物刺激，體現了YCWLD多成分多靶點的治療特點。

2.4 PPI網絡的構建與分析

將34 個作用靶點導入至string 數據庫中，設置organism：Homo sapeins，節點之間的置信度（Combine score）設置為high confidence（0.700）獲取結果后導入cytoscape 中構建PPI網絡圖，詳見圖2。圖中節點表示靶點，邊表示蛋白之間的作用關系，網絡中有34 個節點（其中2 個靶點不連接其他蛋白），126 條邊，度值前六的蛋白為IL6、TNF、AKT1、IL1B、CCL2、ICAM1，分別連接19、18、15、14、14、14 個蛋白，這些蛋白與其他作用靶點關聯密切，在整個調節網絡中起到樞紐的作用，可能成為YCWLD治療NAFLD的關鍵靶點。

2.5 治療靶點類型分析結果

從DisGenet 數據庫依次檢索各個作用靶點，獲得蛋白分類信息并進行頻數統計，詳情見圖3，從圖中可知YCWLD 治療NALFD 過程中以轉錄因子、核酸結合、受體、酶（水解酶、蛋白酶、氧化還原酶、激酶、轉移酶等）、信號分子、酶調節劑、鈣結合蛋白、細胞骨架蛋白、載體蛋白等靶點類型為主。

表2 治療靶點的基本信息

圖1 草藥-候選化合物-治療靶點網路圖

2.6 GO分析以及KEGG通路富集分析結果

圖2 治療靶點的PPI網絡

圖3 治療靶點的分類信息

本研究中將34 個治療靶點導入DAVID 數據庫中進行GO 富集分析以及KEGG 通路分析，GO 分析從分子功能（Molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）和細胞組分（cellular component，CC）三個層面分析了各靶點的功能分布。其中BP 分析中符合P＜0.01的條目有137個，其中富集靶點數前三的分別為positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter、transcription，DNA-templated、inflammatory response，詳見圖4-A；CC分析獲得具有顯著性意義（P＜0.01）的條目6 個，詳見圖4-B。MF 分析中獲得P＜0.01 的 條 目15 個，protein binding、transcription factor activity,sequence-specific DNA binding、Acytokine activity、sequence-specific DNA binding 作用突出，詳見圖4-C。KEGG 分析提示作用靶點涉及43 條信號通路，與NAFLD 可能有關且P＜0.01 的通路有17 條，其中NAFLD、Cytokine-cytokine receptor interaction、Insulin resistance 這三條通路富集靶點數排前三位，并提示這三條通路可能作為YCWLD 治療NAFLD 的重要通路值得進一步探討。此外，圖4-D 結果顯示，通路分析中免疫、炎癥、及物質代謝、凋亡相關通路同樣富集較多靶點，提示調節免疫、抗炎作用、促進物質代謝、減少干細胞凋亡可能是YCWLD 治療NALFD 的重要藥效機制之一。

圖4 GO與KEGG 富集分析結果

2.7 NAFLD信號通路分析結果

根據KEGG 分析結果顯示，聚集靶點最多的為NAFLD 通路，通過R 軟件獲該取通路圖，并用顏色標注作用靶點的化合物數量，如圖5 所示，圖中NAFLD通路通過TNF 信號通路、糖尿病信號通路、脂肪細胞因子信號通路、PPAR 信號等子通路，發揮改善脂肪性肝炎癥、減少脂肪酸合成、改善胰島素抵抗、調節肝細胞壞死及凋亡的作用。由此可知，非酒精性脂肪肝病的發病具有多種病因，而YCWLD 通過多種機制對NAFLD 發揮治療作用。各子通路中胰島素信號通路因靶點可被多種候選化合物可作用，在YCWLD 治療NAFLD 過程中占有重要意義，可作為候選子通路進一步分析。就草藥而言，茯苓、豬苓、桂枝、茵陳、白術、澤瀉分別含有4、4、2、2、1、1 個化合物可作用于NAFLD 通路，茯苓、豬苓含可作用NAFEL 通路單體較多，提示此二種草藥的增減可能對YCWLD 有效成分配比影響較大，可為臨床或者后續實驗驗證中提供借鑒。

3 討論

YCWLD 對NALFD 治療效果確切，但其作用機制尚不明確，目前研究模式多局限于單一靶點或單一生物途徑，難以系統的評估其作用機制。應用網絡藥理學的研究方法可構建多種物質、多個層次相互作用的復雜網絡，能系統地闡述分子之間的關系及復方整體治療效果。此外，也可對單個功能分子進行預測定位及效果評估，對新藥研發具有指導作用[17]。這種研究方式與中醫強調的整體觀及個體化的辯證施藥理念基本一致。故本研究借助此種方法較為系統地預測了YCWLD對NALFD的作用機制。

圖5 YCWLD調控NALFD通路示意圖

中藥及復方化學成分多樣，在體內的代謝過程更加復雜，本次研究將YCWLD 的整體作用量化為多種候選成分的協同作用，借助TCMSP、batman-tcm 兩個數據庫較為全面的檢索出了YCWLD 中類藥性大且通過口服吸收入血較佳的56種成分，對全面預測本方作用機制具有重要意義。然后構建了中藥-化合物-靶點網絡以及PPI網絡，形象直觀的展示出YCWLD調控機制錯綜復雜的作用關系網絡，復雜的網絡結構提示YCWLD發揮治療NALFD的作用是通多成分、多靶點、多機制的形式來實現的。就化合物而言，24個候選化合物能匹配到治療靶點可能成為YCWLD治療NALFD的有效成分，其中quercetin、beta-sitosterol、sitosterol在化合物靶點網絡中可連接多個治療靶點，提示其潛在作用廣泛具有較好的活性可能是調控網絡的關鍵成分。有研究表明quercetin、beta-sitosterol、sitosterol 這三種物質均具有減少NAFLD的肝臟中脂質積累，調節脂質代謝的作用，除此之外，quercetin還具備改善胰島素抵抗的功能，而Sitosterol 則已被驗證可減輕脂肪肝導致的炎癥[18-20]。由此可知網絡中值較高的化合物治療NAFLD的作用與文獻報道基本一致，提示網絡中候選成分具有一定的可靠性，可為進一步研究YCWLD治療NALFD的藥效物質提供新的思路及方向。

本研究中候選化合物的靶點，采用預測結合數據庫檢索兩種方式獲得，并與TTD、CooLGeN、GeneCards數據庫中的NALFD 靶點進行交叉映射，最終獲得YCWLD 治療NALFD 的34 個靶點。PPI網絡表明這些靶蛋白之間非單獨產生作用而是存在復雜交錯的相互作關系；而靶點分類結果則顯示靶蛋白由轉錄因子、核酸結合、受體、酶、信號分子、酶調節因子等多種類型組成。多類型靶點相互協調及靶點間的連通性與中醫的“同病異治”的理念相似，也可能是YCWLD治療NALFD 療效加強的機制之一。就靶點而言，中藥-候選化合物-作用靶點網絡中度值較高的靶點意味著可能被多種候選化合物刺激而產生作用，PPI 網絡中的高度值的靶點則代表具有更好的連通性對整個調控網絡至關重要[21]，因此兩個網絡中的高度值靶點可能在YCWLD 治療NALFD 過程中發揮著核心的作用，值得研究人員重點關注。就候選化合-作用靶點網絡中的靶點而言，DPP4 度值最高，已被證明與胰島素抵抗、NAFLD 以及肝硬化的發生率密切相關[22-23]，經典DPP4 抑制劑如阿格列汀除了可調節血糖改善代謝紊亂外，還可緩解肝臟脂肪變性、保護肝功能、抑制肝星狀細胞（HSC）激活、有助于肝纖維化的緩解[24]。而另外兩種高度值靶點肝X 受體α（LXRα，NR1H3）和肝X 受體β（LXRβ，NR1H3）均屬于II 類核受體的轉錄因子，可以通過調控SREBP1 來影響脂質合成[25]，同時也可以驅動參與肝臟脂質穩態的基因表達，是預防和治療非酒精性脂肪性肝病的重要靶點[26]。有研究進一步表明，當脂肪肝發展到到更具破壞性的炎癥和纖維化階段，NR1H3 也是新型抗炎或抗纖維化的靶標之一[27-28]。此外，靶點中PPARs 的三個亞型PPARA、PPARD、PPARG 雖連接化合物較少，但均已被證明在減少肝臟脂質積聚、緩解炎癥反應、改善解胰島素抵抗等方面具有重要調節的作用，目前已有多種藥物應用于臨床[29-31]。PPI 網絡中其樞紐作用較強的靶點與免疫及炎癥密切相關，其中炎癥是非酒精性脂肪性肝炎的突出標志，肝細胞中的炎癥導致促炎細胞因子的釋放和細胞凋亡的增加，可被視為NAFLD進展的驅動力[32]。免疫細胞的激活同樣會引發肝細胞凋亡，導致組織損傷為晚期纖維化和肝硬化奠定基礎[33]。因此，探索炎癥和免疫相關靶點可以提高對NAFLD 潛在機制的理解，并有助于新療法的開發。上述研究結果表明，本次研究預測的多個核心靶點已被證明具有調控NAFLD 的作用，網絡中其余高度值靶點具有進一步深入研究的價值。

NAFLD 是一種復雜疾病，脂類聚集、炎癥是其發病及進展的兩個重要步驟，也是“二次打擊”學說的兩個重要環節，因此減少肝臟脂肪積累及減輕炎癥是治療NAFLD的關鍵。本研究中功能富集分析結果顯示，NAFLD 的治療靶點主要參與調節轉錄、翻譯及炎癥等生物學過程。這些過程具有改善代謝，促進組織修復及減輕炎癥反應的作用，可從多個方面參與NAFLD病變組織的修復過程，與NAFLD發病機制相吻合。基于KEGG 通路分析顯示NAFLD、Cytokine-cytokine receptor interaction、Insulin resistance 富集治療靶點數較多，提示這三條通路是YCWLD 治療NAFLD 過程中發揮重要作用。其中NAFLD 通路是以疾病直接命名的通路且涵蓋了TNF、insulin 等多條子通路，體現了NAFLD發病機制的復雜性，也揭示了單一的藥物難以達到理想的治療效果的可能原因。相較而言，YCWLD 在多個子通路中均有治療靶點，提示此復方多機制調控的優越性且具有巨大潛在研究價值；其余兩條通路也與有NAFLD 發病以及進展密切相關，其中Cytokinecytokine receptor interaction 與慢性炎癥密切相關，而Insulin resistance 則可導致脂肪細胞中脂解作用受損以及機體過多的向肝臟輸送游離脂肪酸從而造成肝臟脂肪的積累[34]。由此推測YCWLD 可通過調控此二條通路可減少NAFLD“二次打擊”的形成。此外通路分析結果中Mark、Toll-like receptor、NOD、HIF-1 也均已被證明與NAFLD 密切相關[35-38]，且均富集有較多YCWLD 的治療靶點，提示YCWLD 可能通過調控這些通路進而干預NAFLD炎癥和免疫、代謝穩態、脂毒性、肝細胞死亡等發病及進展機制。

綜上所述，本次研究通過網絡藥理學的方法構建了中藥-候選化合物-作用靶點網絡，其中包含6 味中藥、24個候選成分及34個潛在作用靶點。通過分析發現quercetin、beta-sitosterol、sitosterol 可 能 是YCWLD發揮抗NAFLD 作用的關鍵成分，DPP4、NR1H3、NR1H2、SREBF1、SREBF2 在眾多靶點中作用較為突出。調控NAFLD、Cytokine-cytokine receptor interaction、Insulin resistance 等潛在信號通路從而干預炎癥和免疫、代謝穩態、脂毒性、肝細胞死亡等機制可能是YCWLD發揮預防及治療NAFLD的作用的關鍵。本研究系統的預測及分析了TCWLD 治療NAFLD 的機制，為進一步實驗研究YCWLD 抗NAFLD 的關鍵化合物、靶點、通路提供了方向。然而，本次研究僅以各節點關系的數量評估其重要性而并未顧及關系的強度，故此次預測的關鍵節點有一定的偏差。同時在評估YCWLD 的整體作用時，僅考慮各中藥中單體疊加作用，未考慮草藥劑量、煎煮過程各候選化合物的化學反應、以及候選化合是否存在相互干擾吸收等問題，因此本次研究結果仍需進一步實驗進行驗證。