小麥西昌69的EMS誘變系蛋白品質變異分析及種質篩選

于利偉，陳愛艷，郭 雷，羊 陽，李慧敏，謝彥周，劉樹偉，漆小泉，王中華，高 欣

(1.西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100；2.山東大學生命科學學院，山東青島 266237；3.中國科學院植物研究所，北京 100093)

小麥是全球主要糧食作物之一，提供了人們日常所需的主要植物性蛋白質[1]。隨著人們生活水平不斷提高，對小麥面制品的品質要求越來越高，對優質小麥的需求呈不斷上升趨勢。由于小麥遺傳基礎狹窄，優質基因源匱乏，傳統的雜交育種途徑很難獲得突破性種質。人工誘變能夠創造大量變異，通過人工誘變獲得有利用價值的變異材料已成為小麥新種質選育的有效途徑。

引起種群基因頻率大幅度變化的關鍵原因是基因突變[2]?；蛲蛔兛煞譃樽园l突變和誘發突變，自發突變發生的頻率很低，而誘發突變指的是人工誘導產生的變異，其發生率較高。在誘發突變中，化學誘變劑可誘導植物產生可遺傳的變異體，其中甲基磺酸乙酯(EMS)是目前在作物誘變育種中效果較好、被廣泛應用的化學誘變劑[3-5]。EMS誘變產生的點突變頻率高，多為G-C到A-T的轉換，染色體畸變相對較少，多數變異是易于篩查的顯性點突變[6-7]，因此被廣泛應用于突變體的構建。趙天祥等[8]利用EMS誘變小麥偃展4110種子，對M2代全生育期田間表型進行觀察鑒定，獲得了株高在10～15 cm的特矮變異體。秘彩麗等[9]利用EMS處理小麥F1花藥，經培養篩選得到耐鹽突變體。目前，許多研究利用EMS誘變技術構建了突變體庫，并在功能基因組學研究中發揮了重要作用[10]。但對小麥蛋白質變異的研究相對較少，對突變體品質的分析及優質材料的篩選尚缺乏快速準確的方法。本研究以優良小麥品種西昌69的EMS誘變系M6代為試驗材料，對其HMW-GS進行分析，旨在為小麥突變體的品質鑒定提供技術依據，為小麥品質育種提供優質種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為中國科學院植物研究所植物代謝與抗病研究組和山東大學植物細胞工程與種質創新教育部重點實驗室提供的小麥西昌69的EMS誘變系M5代種子。2017年10月份于楊陵西北農林科技大學標本區(108°4′E，34°160′N)種植，每個誘變系種植一行，行長1 m，行間距0.25 m，株距0.03 m，以西昌69為對照。兩次重復。成熟后收獲，得到1 667份M6代誘變系材料。

1.2 試驗方法

通過分析M6代誘變系籽粒品質性狀、高分子量麥谷蛋白亞基組成、不溶性蛋白聚合體含量等，快速篩選出優于親本的誘變系材料。

1.2.1 籽粒品質性狀測定

使用近紅外谷物分析儀分析小麥籽粒品質參數，包括水分含量、粗蛋白含量、濕面筋含量、吸水率、淀粉含量、沉降值、容重、形成時間、穩定時間、出粉率及最大阻力等。兩次重復。

1.2.2 千粒重測定

使用計數板數出200粒小麥籽粒，去除破碎、有病害或蟲蛀過的籽粒，稱重，乘5得到千粒重。三次重復。

1.2.3 高分子量谷蛋白亞基類型鑒定

從收獲的1 667份M6代種子中各取1粒籽粒，利用SDS-PAGE鑒定其高分子量麥谷蛋白亞基組成，參照高 璇等[11]的方法并稍做修改。主要步驟如下：用50%的正丙醇去除樣品中的醇溶蛋白；用樣品提取液[50%正丙醇，0.08 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.0)，1.0%DTT] 65 ℃水浴提取30 min；用烷基化溶液[50%正丙醇，0.08 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.0)，1.4%的4-VP]烷化處理，65 ℃水浴30 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液于新的離心管中，加入上樣緩沖液[80 mmol·L-1的Tris-HCl(pH=8.0)，20%甘油，0.069 mol·L-1SDS， 0.02%溴酚藍染液]后上樣。采用SDS不連續緩沖系統，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為10%，每孔上樣5.5 μL,每板初始電壓設置為100 V。染色液(10%冰醋酸，40%甲醇，0.05%考馬斯亮藍R250)染色約20 min，用脫色液(10%冰醋酸，40%甲醇)脫色約12 h，采用凝膠成像儀觀察并拍照。

1.2.4 籽粒中不溶性蛋白聚合體含量(UPP) 測定

參照劉天紅[12]的方法提取M6代種子的UPP；利用安捷倫HPLC色譜儀和Biosep-SEC-S3000排阻色譜柱(孔徑300 ?，粒徑3.5 mm，300 mm，7.8 mm)分析樣品的蛋白質含量。以含0.05%三氟乙酸的50%(v/v)乙腈溶液為流動相進行沖洗，流速0.5 mL·min-1，沖洗30 min。采用手動積分獲取各個組分的比值，UPP值為SDS-不溶性聚合體蛋白的面積占SDS-可溶性聚合體蛋白和SDS-不溶性聚合體蛋白面積之和的百分比。兩次重復。

2 結果與分析

2.1 M6代EMS誘變系籽粒品質性狀的變異

2.1.1 籽粒水分含量的變化

小麥籽粒內部復雜的生理生化過程都與其水分狀態有關，淀粉和蛋白質等生物大分子的水合狀態決定了淀粉合成途中關鍵酶的活性，從而影響淀粉的合成。由此可見，小麥籽粒的水分含量嚴重影響小麥產量及品質的形成[13]。西昌69的水分含量為11.52%，其M6代誘變系的水分含量平均為12.14%，最大值為14.48%，最小值為10.56%(圖1A)。

2.1.2 籽粒粗蛋白含量的變化

小麥籽粒粗蛋白含量與面粉和面團的多個質量指標存在正相關關系，與面包烘焙品質存在顯著正相關關系，是影響面包質量的決定因素[14-15]。西昌69的粗蛋白含量(干基)為16.37%，其M6代EMS誘變系的粗蛋白含量(干基)平均為 18.65%，最大值為24.55%，最小值為12.37%(圖1B)。

2.1.3 籽粒濕面筋含量的變化

西昌69的濕面筋含量為34.20%，其M6代EMS誘變系的濕面筋含量平均為39.40%，最大值為 52.50%，最小值為24.83%(圖1C)。

2.1.4 籽粒淀粉含量的變化

小麥籽粒中淀粉和蛋白質含量共同決定了小麥的加工品質[16]。小麥西昌69的淀粉含量為62.31%，其M6代EMS誘變系的淀粉含量平均為67.13%，最大值為79.97%，最小值為 52.34%(圖1D)。

2.1.5 面團形成時間的變化

小麥面團的形成時間與面包外觀存在顯著負相關關系[14]。西昌69的形成時間為4.20 min，其M6代EMS誘變系的面團形成時間平均為 4.67 min，最大值為6.50 min，最小值為0.95 min(圖1E)。

2.1.6 面團穩定時間的變化

小麥面團的穩定時間與面包膨脹度、面包體積存在顯著正相關關系，但與面包外觀存在顯著的負相關關系[14]。小麥西昌69的穩定時間為13.40 min，其M6代EMS誘變系的面團穩定時間平均為16.40 min，最大值為32.55 min，最小值為 2.75 min(圖1F)。

2.1.7 籽粒沉降值的變化

小麥沉降值是衡量小麥面筋數量和質量的間接綜合指標，沉降值越大，表明面筋強度越大[17]。小麥西昌69的沉降值為40.22 mL，其M6代EMS誘變系的沉降值平均為47.09 mL，最大值為71.58 mL，最小值為25.21 mL(圖1G)。

2.1.8 籽粒容重的變化

小麥容重對面粉的品質性狀有一定影響[17]。小麥西昌69的容重為789.5 g·L-1，其M6代EMS誘變系的籽粒容重平均為775.1 g·L-1，最大值為834.5 g·L-1，最小值為726.5 g·L-1(圖1H)。

A：水分含量；B：粗蛋白含量；C：濕面筋含量；D：淀粉含量；E：形成時間；F：穩定時間；G：沉降值；H：容重。

2.2 M6代千粒重的變化

小麥籽粒產量與其蛋白質含量一般呈負相關[18]，千粒重是影響產量的重要因素。小麥西昌69的千粒重為50.76 g，其M6代EMS誘變系的千粒重平均為46.02 g，最大值為60.83 g，最小值為26.23 g(圖2)。

圖2 西昌69 EMS誘變系M6代籽粒的千粒重

2.3 M6代籽粒中高分子量谷蛋白亞基的變異

SDS-PAGE結果(圖3)表明，西昌69的高分子量麥谷蛋白亞基組成為1、17+18和2+12，對 1 667份M6代籽粒進行高分子量麥谷蛋白亞基鑒定和分析，與西昌69對比，發現101份高分子量麥谷蛋白亞基變異型材料，變異率為6.06%。在101份HMW-GS變異材料中，共鑒定出19種不同的HMW-GS組合類型，其中亞基缺失型3種，共16份變異材料；亞基置換型型8種，共34份變異材料；亞基缺失且發生置換8種，共27份變異材料；有24份變異材料出現了新型亞基，有待進一步研究。

圖3 西昌69 EMS誘變系M6代籽粒HMW-GS的SDS-PAGE圖譜

由表2可知，在Glu-A1位點上的變異主要表現為1亞基的缺失及1亞基變為2*亞基，其中1亞基缺失(null)出現頻率最高，達30.69%。這與前人研究結果相似，即在Glu-A1位點上，null為優勢亞基變異類型[19-22]。

表2 西昌69EMS誘變系的M6代籽粒HMW-GS變異分析

在Glu-B1位點上，HMW-GS的變異類型較為豐富，檢測到7+8、7+9、14+15共3種類型，以7+8亞基出現頻率最高(20.79%)，7+9亞基次之(14.85%)。這3種亞基組合與親本的17+18亞基相比，并不優質[23]。造成這種現象的主要原因是EMS誘變是無方向性的，在部分材料品質提高的同時，可能會使部分材料的品質降低。

在Glu-D1位點上的變異，主要表現為2亞基或12亞基的缺失以及2+12亞基變為5+10亞基，其中5+10亞基變異頻率最高(26.73%)。表明5+10亞基為西昌69的EMS誘變系在Glu-D1位點的主要變異形式。

2.3 M6代籽粒UPP值的變化

面粉的UPP含量與蛋白質、沉淀值等主要品質參數顯著正相關，面粉的UPP值越大，小麥的綜合質量越好[24]。在101份HMW-GS變異材料中，根據籽粒重要品質性狀，如水分含量、粗蛋白含量、濕面筋含量、沉降值、形成時間、穩定時間等，篩選出35份優于親本品質性狀的變異材料，利用高效液相色譜技術，對其進行UPP值分析。結果發現，西昌69的UPP值為31.16%，35份誘變系材料的UPP值平均為35.88%，最小值為27.47%，最大值為45.84%，變異率為58.95%。其中，有7份材料(M1020、M1313、M1455、M1648、M1652、M1730、M1778)的UPP值略低于親本，其余28份材料的UPP值均大于親本(表3)。

比較35份篩選出的M6代籽粒的UPP值及千粒重(表3)，發現其UPP和千粒重均超過親本的誘變系有：M636、M783、M1346、M1503，其余多個材料的千粒重與親本相差無幾；且大部分誘變系的UPP值大于親本。有28份具有優于親本籽粒品質性狀且千粒重相對穩定的誘變系材料。

表3 35份優質西昌69 M6代EMS誘變系的千粒重及UPP

表1 EMS誘變西昌69的M6代籽粒HMW-GS組成類型

3 討 論

目前,許多研究利用EMS誘變技術構建了突變體庫，并在功能基因組學研究中發揮了重要作用[10]，但針對與小麥品質相關的貯藏蛋白變異的研究相對較少。本研究結果表明，西昌69的EMS誘變系M6代籽粒品質性狀與親本相比差異較大，其中，穩定時間的變異率最大。原因可能是穩定時間由多個位點控制[25]，誘變系的HMW-GS有豐富的變異類型。前人研究顯示，EMS誘變易導致控制編碼HMW-GS的基因發生沉默[26]，如徐艷花等[27]利用EMS誘變豫農201種子，發現其M2代突變體有21個缺失不同亞基的突變體，突變頻率為2.26%。本研究中，在Glu-A1位點和Glu-D1位點均發生亞基的缺失，突變頻率為2.28%，突變頻率均較高。原因可能是EMS誘變導致DNA片段上出現單堿基的變化或缺失，進而表現為蛋白的缺失。一般來說，EMS誘變產生的HMW-GS不良變異較多，而優良變異較少[8]。本試驗也獲得了一些優質亞基組合，如1、17+18、5+10，null、17+18、5+10，null、17+18、2+12為變異材料中優質亞基類型，含有這些亞基的多個籽粒品質性狀有所提高。這與前人關于17+18、5+10為優質亞基的結論相符[23,28]。另外，劣質亞基組合主要在Glu-B1位點產生，原因可能是EMS誘變在編碼Glu-B1的基因中產生比其他基因更多的過早終止密碼子，從而使蛋白組成發生改變[29]。在本研究中，還有部分誘變系出現了新型亞基，在閆 炯等[26]的研究中也出現了相似的結果，在Glu-B1和Glu-D1位點呈現出缺失和新增亞基2種情況。原因可能是經過EMS誘變處理以后，引起了基因的沉默和新基因的表達或引起麥谷蛋白結構基因的變異，從而導致小麥在蛋白水平上發生了變異[30]。本研究僅獲得初步結果，關于新型高分子量谷蛋白亞基所產生的原因及其對小麥品質的影響還需進一步更深入研究。

小麥的粗蛋白含量、濕面筋含量、穩定時間及形成時間等籽粒品質性狀與強筋小麥品質顯著正相關[31]，UPP與小麥綜合質量呈正相關關系[24]。本研究篩選出的28份較親本UPP提高的誘變系，其各品質性狀也優于親本。在今后誘變材料的篩選中，UPP可以作為微量快速、鑒定及篩選優質誘變材料的指標。對于篩選出的28份品質提高的誘變系，我們將會在不同環境條件下種植，以檢驗其品質穩定性。