副雞禽桿菌外膜囊泡的生物學活性分析

梅 晨 ， 孫愛華 ， 李淑芳 ， 龔玉梅 ， 王宏俊

(北京市農林科學院畜牧獸醫研究所 畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室 ， 北京 海淀 100097)

副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum, Apg)是雞傳染性鼻炎(IC)的病原[1]，為革蘭陰性菌，主要引起育成雞生長停滯及蛋雞產蛋率下降[2]，給養雞業造成了重大經濟損失[3]。目前控制雞傳染性鼻炎的方法主要是采用全菌滅活疫苗[4-6]配合抗生素治療或預防的綜合措施。

外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMVs)是細菌特有的一種生理結構，革蘭陰性菌及少量革蘭陽性菌都可以產生OMVs[7]。OMVs是一種雙層膜球狀囊泡狀結構，其大小在20～250 nm[8]。OMVs在細菌的生長、生存、毒力等生理活動中扮演重要角色，由于OMVs不能復制且含有脂多糖、外膜蛋白、磷脂及少量DNA等成分，能有效激活免疫系統，被認為是極具潛力的新型疫苗之一[8]，但其作用機制尚不明確。本試驗擬探討副雞禽桿菌外膜囊泡的相關生物活性，為雞傳染性鼻炎新型疫苗研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種 副雞禽桿菌A型hp8株, B型BJ株和C型668株由本實驗室保存。

1.2 囊泡的提取及純化 常規兼性厭氧條件下培養hp8株副雞禽桿菌，挑取單菌落于TSB培養基中，37 ℃溫箱震蕩厭氧培養12 h，按1∶50轉接，37 ℃溫箱震蕩厭氧培養4～6 h，4 ℃，8 000 r/min離心10 min。取上清，0.45 μmol/L濾膜過濾，4 ℃，35 000 r/min超速離心3 h，棄上清。用2 mL 20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液 (pH值7.5)重懸沉淀，存放于-20 ℃。即為粗提的外膜囊泡。

用HEPES溶液將Optiprep配置成不同梯度濃度(60%、40%、35%、30%、25%、20%)，取上述粗提外膜囊泡與60%的Optiprep溶液按1∶3體積比稀釋至45%，吸取2 mL置于離心管底部，再依次加入上述40%及更低濃度的Optiprep溶液各 2 mL。4 ℃,35 000 r/min離心3 h。離心后吸取肉眼可見的黃色層，即為目標囊泡所在溶液。重懸富含囊泡溶液樣品于10倍體積DPBSS，4 ℃,35 000 r/min離心3 h，去除溶液中Optiprep，以2 mL的DPBSS懸浮囊泡，即為純化的外膜囊泡。BCA法計算OMVs的濃度，透射電鏡觀察其形態及結構。

1.3 OMVs對HD-11細胞NO生成量的影響 一氧化氮(Nitricox-ide，NO)是一種生物信使分子，其生成依賴于誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)，在抵抗入侵的細菌、真菌等微生物及在炎癥反應中起著十分重要的作用[10-11]。試驗分為OMVs處理組(5 μg/mL)和對照組，兩組細胞分別在處理后24 h、48 h時取培養上清液，根據NO試劑盒說明書操作步驟及計算公式[12]，測定并計算各組OD550值，利用SPSS比較各組NO產生水平。

1.4 熒光定量PCR(qPCR)檢測OMVs對HD-11細胞相關炎癥因子表達的影響 在25 cm2培養瓶中常規培養雞巨噬細胞(HD-11)，使細胞生長至85%。6瓶細胞分為囊泡組、脂多糖(LPS)組和對照組，每組2瓶。囊泡組加入5 μg OMVs，脂多糖組加入1 μg/mL LPS, 對照組不做任何處理，之后共培養24 h和48 h。分別用TRIzol法提取細胞總RNA[9]，溶于20 μL DEPC水。反轉錄按照說明書進行，具體反應體系如下:RNA 1 μg，隨機引物1 μL，5×M-MLV TR Buffer 4 μL，核糖核酸酶抑制因子1 μL，M-MLV反轉錄酶1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)8 μL。混勻后按以下程序進行反轉錄：42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min，反應結束后立即置于-20 ℃保存備用。

根據GenBank上雞炎癥因子相對保守區域序列，用Primer 5軟件設計基因的特異性上下游引物(見表1)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應體系如下：1 μL cDNA，上、下游引物各1 μL，12.5 μL Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix，0.375 μL ROX，9.125 μL DEPC水。反應條件：95 ℃預變性 10 min; 95 ℃變性 30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸60 s，循環40次;72 ℃再延伸8 min。 溶解曲線反應條件如下：95 ℃ 1 min，58 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。所有試驗組樣本重復3次獨立試驗，利用SPSS比較各組炎癥因子水平。

表1 相關炎癥因子引物序列

1.5 OMVs疫苗的制備與免疫 純化的OMVs與MONTANIDETMISA 71 VG佐劑(SEPPIC公司產品)按3∶7的質量比(抗原∶佐劑)混合乳化，所制備的疫苗命名為V-OMVs-A，其中OMVs蛋白濃度為100 μg/mL。將42日齡SPF試驗雞分為OMVs免疫組(30只)和PBS對照組(30只)。OMVs組試驗雞胸部肌肉注射V-OMVs-A疫苗，0.5 mL/只，間隔2周后二免；對照組接種PBS替代OMVs后制成的疫苗，0.5 mL/只，間隔2周后再同劑量接種1次。

1.6 血清IgG的測定 首次免疫后每周進行雞靜脈竇采血并分離血清，根據參考文獻[13]，采用間接ELISA測定抗OMVs的血清IgG抗體水平；將全菌抗原用包被液稀釋至1 μg/μL，包被于96孔酶標板，4 ℃過夜，以1∶100稀釋的血清作為一抗，1∶10 000稀釋的山羊抗雞IgG-HRP (Sigma公司)作為二抗，通過TMB底物顯色測定OD450值。

1.7 免疫保護試驗 二免4周后，試驗雞分別用3個血清型的副雞禽桿菌眶下竇接種攻擊。A型(hp8株)、B型(BJ株)和C型(668株)，劑量依次為A型5×105CFU/0.2 mL，B型2×105CFU/0.2 mL，C型5×105CFU/0.2 mL。連續觀察1周，記錄試驗雞的臨床發病情況，包括流鼻涕、眼瞼腫、溢淚等。

2 結果

2.1 外膜囊泡電子顯微結構 以乙酸雙氧鈾負染后，用透射電鏡觀察外膜囊泡形態。經BCA方法測得提取的外膜囊泡的蛋白質濃度為1.03 mg/mL，結果如圖1和圖2所示：可見多數形態呈現圓球狀，有膜狀結構，OMVs直徑介于20～300 nm。

圖1 副雞禽桿菌(Apg)及其外膜囊泡(OMN)

圖2 純化的副雞禽桿菌外膜囊泡

2.2 OMVs對HD-11細胞NO生成量的影響 結果如圖3可知，24 h時OMVs組生成的NO量急速增加，為10.5 μmol/L；而對照組生成的NO量為2.5 μmol/L，差異極顯著(P<0.01)。48 h時，OMVs組生成的NO量為11 μmol/L，對照組NO量為4 μmol/L，差異極顯著(P<0.01)。表明OMVs可以刺激HD-11細胞產生NO，且隨時間推移生成量有所增高。

圖3 OMVs作用不同時間對HD-11細胞NO生成影響

2.3 q-PCR檢測多因子的表達 結果如圖4所示，24 h時，與對照組相比，IL-1β、IL-10、iNOS囊泡組及脂多糖組差異極顯著(P<0.01),IL-6囊泡組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，脂多糖組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，IL-2囊泡組與對照組相比差異顯著(P<0.05)。48 h時，以上5種細胞因子囊泡組及脂多糖組與對照組相比，均差異極顯著(P<0.01)。

圖4 OMVs影響HD-11細胞相關炎癥因子表達

2.4 血清IgG抗體水平的測定 二免后第4周分別測定各組雞血清IgG水平，結果如圖5所示，OMVs免疫組的IgG抗體水平極顯著高于對照組(P<0.01)，推斷OMVs免疫雞后可刺激機體產生較強的體液免疫。

圖5 OMVs對雞血清IgG抗體水平的檢測結果

2.5 OMVs免疫保護試驗 二免后第4周，試驗雞用副雞禽桿菌A、B、C三個血清型強毒攻擊，結果顯示，對照組所有的試驗雞陸續發病，都表現出嚴重的鼻炎癥狀，發病率為100%。OMVs組A型攻毒后僅有3只試驗雞表現出鼻炎癥狀，保護率為7/10，B型及C型攻毒保護率分別為1/10和3/10，提示囊泡免疫原性具有型特異性(表2)。

表2 免疫雞對Apg菌株攻毒的保護效果

3 討論

外膜囊泡(OMVs)是革蘭陰性菌普遍存在的一種生理結構，部分革蘭陽性菌也會產生。對副雞禽桿菌的OMVs各個方面的研究還不夠深入，目前仍處于探索的過程中。本文通過提取、純化副雞禽桿菌A型菌(hp8)外膜囊泡OMVs，探索其對雞巨噬細胞HD-11相關炎癥因子表達的影響。NO作為一類小分子細胞調節因子，在炎癥反應過程中發揮重要的指示作用。結果顯示，OMVs與HD-11細胞共培養后，細胞產生NO的水平極顯著升高，提示OMVs可增強HD-11細胞免疫活性。生成的NO可以進一步促進巨噬細胞釋放IL-6和TNF-α等炎性因子，增強細胞免疫反應。IL-lβ、IL-6等主要由巨噬細胞釋放，通過qPCR檢測相關炎癥因子的表達，結果顯示，OMVs可促進HD-11細胞IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、iNOSmRNA表達升高，提示巨噬細胞被極顯著激活，能夠明顯促進炎癥反應[14]。另外，囊泡組血清IgG與對照組相比差異顯著，說明OMVs可以調節雞體液免疫。攻毒保護試驗結果顯示，OMVs免疫后能夠提高雞對副雞禽桿菌攻擊的耐受力，表明該OMVs含有部分關鍵保護性抗原成分。

目前，已有研究探索了多種細菌OMVs作為亞單位疫苗候選抗原的可行性[15]，本研究也進行了初步嘗試。攻毒試驗結果顯示，A型副雞禽桿菌的OMVs接種后的雞只可以產生較好的免疫保護作用，耐受同型菌株的攻擊。但對B型和C型交叉保護效果較差，這可能與不同亞型的副雞禽桿菌分泌囊泡中攜帶外膜蛋白成分不同有關，外膜囊泡中免疫保護性抗原成分具有型特異性。在后續試驗中，筆者將通過比較不同亞型副雞禽桿菌囊泡外膜成分，篩選免疫保護的有效成分，并在后續試驗中采取不同免疫方式及免疫劑量研究囊泡的保護效果，借此研究雞傳染性鼻炎亞單位疫苗。