觀賞雞中禽白血病病毒分離鑒定及全基因測序分析

劉福林 ， 曹 紅 ， 王亞楠 ， 武沛澤 ， 海 偉 ，王宏鈞 ， 李 三 , 余德海 ， 陳福勇 ， 常建宇

(1.中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.四川天兆豬業股份有限公司 ， 重慶 渝北 401100)

禽白血病(Avian leucosis, AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)感染引起的，主要以造成被感染動物細胞惡性增生的腫瘤疾病為主要特征。根據囊膜蛋白抗原性的不同，ALV分為 A～J共10個亞群。其中在雞群中流行的 A、B、C、D四個亞群是1980年以前確定的，在雞群中誘發腫瘤的主要是 A、B亞群ALV。C、D亞群在臨床上少見，報道較少。E亞群則是普遍存在的內源性禽白血病病毒，對宿主無致病性。F～I亞群ALV分離自雞以外的宿主動物，而J亞群是20世紀90年代初從肉雞中分離到的一種新型外源性病毒[1]。近年的ALV流行病學調查結果表明，我國禽白血病病原主要為J亞型，該病毒給養禽業帶來了嚴重的經濟損失[2-5]。目前國內商業蛋雞、肉雞及地方品種雞都有感染禽白血病的報道[6-9]。

元寶雞作為名貴的觀賞雞，有一定的觀賞價值，它體型嬌小、生性活潑，深受世人喜愛。迎合全球發展微型特種禽的潮流，被譽為絕世珍品。國內元寶雞養殖業剛剛起步，其經濟效益是普通雞的3～4倍，國內外市場潛力巨大，是高效農業的新項目。目前國內尚無關于其禽白血病方面的報道，因此對其進行禽白血病的調查很有必要。本試驗從觀賞元寶雞血漿中分離1株禽白血病病毒，并命名為BJ1401。完成其全基因序列的測定，并將測序結果與已發表序列進行同源性分析和制作進化樹。本試驗為防控和凈化元寶雞雞群中禽白血病提供理論依據，并可豐富中國地方品種雞的分子流行病學資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 血漿樣品來自于北京某觀賞禽交易市場，雞品種為元寶雞。禽白血病抗原檢測試劑盒為美國IDEXX產品。DF-1細胞由本實驗室保存。DMEM、FBS、胰酶，均購自Gibco公司。DH5α、克隆用PEGM-T載體、工具酶、組織/細胞DNA提取試劑盒，為北京全式金生物技術有限公司。

1.2 病毒的分離和鑒定 參照王笑梅的方法[10]，將待檢測的血漿樣品接種于DF-1，同時設DF -1細胞陰、陽性對照。細胞上清ALV p27抗原ELISA檢測按照抗原檢測試劑盒(IDEXX)使用說明書進行。上清為陽性的樣品，細胞沉淀用于提取ALV前病毒基因組DNA。

1.3 ALV前病毒DNA的制備 收集陽性上清細胞沉淀，按照Genomic DNA Kit說明書制備ALV前病毒基因組DNA。

1.4 引物合成和基因組cDNA的PCR擴增 參考張青嬋的論文[11]合成5對連續且相互重疊覆蓋全序列的引物，引物序列見表1，以1.3中樣品為模板進行PCR擴增。全部引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物核苷酸序列

1.5 核酸序列片段克隆和測序 取PCR已純化產物1 μL連入5 μL pEGM-T載體，轉化DH5α，選陽性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 核酸序列的相似性比較和進化分析 應用DNASTAR軟件，對6個PCR片段克隆的測序結果進行拼接，將獲得的BJ1401株前病毒基因組核苷酸序列與國內外公開發表的病毒株進行遺傳進化及相似性比較分析。參考毒株為： RAV-1 (A亞群代表株)、MQNCSU (A亞群美國株)、MAV-1、SDAU09C3 (A亞群中國株)，SDAU09C2 (B亞群中國株)，ev-1(E亞群代表株)、SDO501 (E亞群中國株), Prague C (C亞群代表株),RSV-SR-D (D亞群代表株), HPRS103(J亞群原始毒株)，基因庫登錄號依次為: M19113、DQ365814、L10922、HM452340、HM446005、AY013303、EF467236、J02342、D10652、Z46390。

2 結果

2.1 病毒的分離及鑒定 觀賞型元寶雞雞群的血漿接種DF1細胞后，經過傳代獲得細胞上清，p27檢測為陽性，獲得1株外源ALV，命名為BJ1401。

2.2 BJ1401株基因組cDNA的PCR擴增 利用5對擴增cDNA的全基因組引物進行PCR擴增，均擴增出了5段與預期大小相符的DNA片段(圖1)。

2.3 BJ1401株基因組序列結構 利用DNASTAR軟件對BJ1401株的測序結果進行拼接，獲得了其cDNA全序列。BJ1401株序列全長7 503 bp, 其中gag基因長為2 106 bp；pol基因長為2 687 bp;env基因長為1 799 bp; 兩端相同的LTR均長為283 bp。

2.4 BJ1401株核苷酸序列比對 利用DNASTAR軟件分析表明，BJ1401株gag基因核苷酸與各亞群參考株同源性在95.5%～99.0%，與E亞群相似性最高(99.0%)。pol基因核苷酸與各亞群參考株同源性在97.3%～99.6%，與E亞群相似性亦最高(99.6%)。gp85基因核苷酸序列與C亞群Prague C株相應核苷酸序列相似性最高(91.6%)，與J亞群原型株HPRS-103相似性最低(50. 3%)，與各代表株的核苷酸序列相似性在50.3%～91.6%。gp37核苷酸序列與E亞群同源性高達98.2%，與A、B、C、D亞群，相應序列同源性在92.7%～94.3%，與J亞群同源性只有59.5%。LTR核苷酸序列與E亞群同源性最高(91.6%)，與其他各亞群同源性低于68.0%(表2)。

表2 BJ1401株各核苷酸片段與不同亞型毒株相應核苷酸序列的同源性

2.5 BJ1401株核苷酸序列的進化分析 利用MEGA6.0軟件對BJ1401株部分核苷酸片段進行進化分析表明，BJ1401株gp85核苷酸序列與C亞群美國株Prague C的親緣關系最近，與C亞群同在一個進化支上，與J亞群ALV分離株相比，A、B、C和E亞群ALV分離株親緣關系較近，同屬一個大的進化支(圖2)。gp37核苷酸序列與E亞群ev-1及SD0501株親緣關系最近，與E亞群同在一個進化分支上(圖3)。LTR核苷酸序列與E亞群ev-1、SD0501株親緣關系亦最近(圖4)。

圖2 BJ1401株gp85基因的系統進化樹

圖3 BJ1401株gp37基因的系統進化樹

圖4 BJ1401株LTR基因的系統進化樹

3 討論

國內己經有很多關于禽白血病的報道，但主要集中在家禽上，尚無有關觀賞性元寶雞感染禽白血病的報道。本試驗報道了觀賞性元寶雞中存在禽白血病病毒的感染，由于目前樣本數量較少，不能有效計算其感染率，還需要進一步加大樣本采集進行檢測，并分析其基因特征，以便掌握元寶雞雞群中流行的禽白血病的分子特征。為確保我國具有經濟價值的觀賞禽免受禽白血病等腫瘤疾病的侵害，我們應掌握元寶雞中禽白血病的流行動態，以便采取相應的保護和防控措施。

BJ1401株gag和pol基因核苷酸序列相對保守，但同源性顯示更接近于E亞群。gp85基因核苷酸序列與C亞群同源性最高，并且處在同一進化分支上，gp37、LTR基因核苷酸序列與E亞群相應序列同源性最高，且遺傳關系也最近。因此，僅從同源性和遺傳進化角度分析，元寶雞中分離株BJ1401很可能是C亞群E亞群禽白血病病毒重組的結果。雖然BJ1401株具有內源性E亞群的全基因主干，但它具有外源性病毒的gp85基因，因此可以在DF-1細胞上感染和增殖。

我國地域遼闊，氣候地理條件多種多樣，各地飼養著許多不同特性和不同遺傳背景的地方品系雞群。長期以來，這些雞群可能一直存在著ALV感染，但從來都沒有做過ALV的凈化，地方品系雞存在不同基因組結構的ALV的可能性就很大。因此，本試驗從我國觀賞性雞群中分離1株不同于己知6個亞群ALV的基因結構就不足為奇了。但是，對于該毒株對雞的致病性及其生物學特性有待進一步研究。