1株豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定、毒素基因檢測、分型及藥敏試驗

劉 洋 ， 龍 劍 ， 梁 婭 ， 廖華媛 ， 李潤成

(湖南農業大學動物醫學院 ， 湖南 長沙 410128)

豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia, PCP)是一種由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae, APP)引起的烈性傳染性呼吸道疾病，其死亡率極高，主要臨床癥狀表現為出血性纖維素性肺炎和壞死性纖維素性肺炎[1]。隨著我國集約化養豬業的急速發展以及區域之間的頻繁引種，該病在我國的流行趨勢日漸上升，現已成為我國豬群主要的細菌性呼吸道傳染病之一，給我國的養豬業造成了巨大的經濟損失。

APP有2種分型方式，第1種以其生長時是否依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)為條件分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，其中生物Ⅰ型生長需要NAD，生物Ⅱ型生長不依賴NAD[2]。根據APP脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)和莢膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)的差異又可以將其分為18種血清型，其中血清型16型、17型和18型在2015-2018年才被發現[3-7]。

傳染性胸膜肺炎放線桿菌的侵襲力和持久性與眾多毒力因子相關，Apx毒素是其主要的毒力因子之一。Apx毒素包括Apx I、Apx II、Apx III和Apx IV，其中Apx I具有很強的溶血性和細胞毒性，其能誘導豬的肺泡巨噬細胞發生細胞凋亡；Apx II的溶血性和細胞毒性相對較弱；Apx III無溶血性但具有很強的細胞毒性，其能對外周單核細胞造成巨大的損傷；Apx IV雖然毒性較小，但APP的所有血清型都含有該基因，可以將其視為鑒定APP菌株的特異性基因[2,8-9]。

2018年12月，浙江慈溪某規模化豬場部分肥豬出現體溫升高、呼吸困難、咳嗽等癥狀，對死亡豬只進行剖檢，其主要病理變化為纖維素性肺炎、心包炎和胸腔積液，見封三彩版圖1、2，疑似APP感染。取病死豬的肺臟進行了細菌分離鑒定、毒力基因檢測、血清型鑒定、生物型鑒定及藥敏試驗，報告如下。

1 材料

1.1 病料 2018年12月，病料采集于浙江慈溪某規模化豬場病死豬的肺臟。

1.2 培養基 TSB培養基，購自OXOID公司；巧克力平板，購自貝瑞特公司；血瓊脂平板，購自江門公司。

1.3 試劑 小牛血清，購自益康生物公司；革蘭染色試劑及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，均購自北京索萊寶科技有限公司；即用型PCR試劑盒3.0(Mix)，購自北京天恩澤生物技術有限公司；2 000 DNA Marker及Super DNA Marker，均購自北京康為世紀公司；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。

2 方法

2.1 細菌分離及革蘭染色鏡檢 用無菌接種環鉤取病死豬的肺臟接種于巧克力平板上，將巧克力平板置于37 ℃溫箱中培養24 h，次日觀察菌落的大小及形態，從中挑取單菌落純化并進行革蘭染色鏡檢。

2.2 16S rDNA PCR檢測 參照文獻[10]中的方法合成細菌16S rDNA通用引物。以分離菌株為模板，用16S rDNA通用引物進行PCR擴增。PCR程序：預變性94 ℃ 5 min; 變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，30個循環; 再延伸72 ℃ 7 min。PCR體系：Mix 25 μL，純水22 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL,模板1 μL。將PCR產物送至擎科生物技術有限公司進行測序并對測序結果進行分析。

2.3Apx毒素的鑒定 按照廖華媛等[11]的方法合成Apx毒素基因檢測引物。以分離菌株為模板，用4對毒素基因檢測引物進行PCR擴增。PCR程序：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，ApxI退火65 ℃，ApxII退火63 ℃，ApxIII及ApxIV退火61 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 30 s，30個循環；再延伸72 ℃ 7 min。PCR體系：Mix 25 μL，純水22 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板1 μL。

2.4 血清型及生物型分型 將分離菌株接種于涂有NAD的血瓊脂平板及未涂NAD的血瓊脂平板上，置于37 ℃溫箱中培養24 h，次日觀察細菌是否生長，若分離菌株的生長需要依賴NAD，則說明其為生物Ⅰ型，若分離菌株的生長不依賴NAD，則說明其為生物Ⅱ型[2]。按照Bossé等[12]的方法合成血清型鑒定引物，對該菌株進行血清型鑒定，PCR方法按常規進行。

2.5 藥敏試驗 使用K-B法對分離菌株進行藥敏試驗。將分離菌株接種至含10%小牛血清及1‰NAD的TSB培養基中，于37 ℃，180 r/min搖床中培養12 h。將培養好的細菌用無菌水稀釋至0.5麥氏單位濃度，吸取100 μL稀釋菌液用涂布器均勻涂于巧克力平板上，待液體吸干后將藥敏試紙片輕輕貼在巧克力平板上，于37 ℃溫箱培養24 h，次日記錄抑菌環的直徑并根據其結果判斷分離菌株對不同藥物的敏感程度。

3 結果

3.1 細菌分離 用無菌接種環鉤取病死豬的肺臟接種于含NAD的巧克力平板上，并從中挑取單菌落進行純化。在巧克力平板中長出了直徑為1～3 mm、圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊的灰白半透明菌落。見封三彩版圖3。

3.2 革蘭染色鏡檢 從純化過的巧克力平板中挑取單菌落進行革蘭染色鏡檢，在顯微鏡中看到了大量革蘭陰性桿菌，多散發呈桿狀，也有短鏈狀。其大小和形態與傳染性胸膜肺炎放線桿菌極其相似，革蘭染色鏡檢見封三彩版圖4。

3.3 16S rDNA PCR檢測 以分離菌株為模板，用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，結果擴增到了與預期大小相符的特異性條帶，見圖5。將PCR產物送至長沙擎科生物技術有限公司測序，測序結果與GenBank中已發表的APP基因序列的同源性為99%，確定該分離菌株為APP。

圖5 16S rDNA PCR結果

3.4Apx毒素的鑒定結果 對分離菌株進行Apx4種毒素的PCR鑒定，鑒定結果顯示該菌株含有ApxII(358 bp)、ApxIII(320 bp)、ApxIV(634 bp)3種毒素基因。DNA電泳圖見圖6。

圖6 Apx毒素基因鑒定結果

3.5 生物型及血清型鑒定 將分離菌株涂板于含NAD的血瓊脂平板及不含NAD的血瓊脂平板上，置于37 ℃溫箱中培養24 h，次日發現含NAD的血瓊脂平板上有菌落生長且伴隨有溶血現象，而不含NAD的血瓊脂平板上無菌落生長，說明分離菌株在生長過程中需要依賴NAD，其屬于生物Ⅰ型。據文獻報道[8,13-14]，能同時產生Apx II、Apx III、Apx IV 3種毒素的APP血清型只有2、3、4、6、8型及15型，參照文獻[12]合成了2、3、4、6、8型及15型血清型鑒定引物并對分離菌株進行了血清型鑒定，結果顯示，該菌株為APP 15型菌株。將PCR產物送至長沙擎科生物技術有限公司進行測序，對測序結果進行BLAST比對，結果顯示該序列與GenBank中APP 15型基因序列的同源性為99%，確定分離菌株的血清型為15型。APP 2、3、4、6、8、15型血清型PCR鑒定結果見圖7。

圖7 APP 2、3、4、6、8、15型血清型鑒定結果

3.6 藥敏試驗 藥敏試驗結果顯示，分離菌株對頭孢曲松、恩諾沙星、氨芐西林及復方新諾明4種藥物較為敏感，對鏈霉素有較強的耐藥性。見表1。

表1 分離菌株部分藥敏試驗結果

4 討論

本試驗從浙江慈溪某豬場病死豬的肺臟中分離到了1株細菌，其形態大小與APP相似，經16S rDNA PCR鑒定后，確定該菌株為APP菌株。后對其進行了4種Apx毒素基因的檢測，發現該菌株同時含有ApxII、ApxIII和ApxIV 3種毒素基因。查閱文獻發現同時含有ApxII、ApxIII和ApxIV毒素基因的APP血清型可能為2、3、4、6、8型或者15型，利用上述6種血清型的鑒定引物對分離菌株進行了PCR鑒定，最終確定其為APP 15型菌株。在培養細菌的過程中，發現該菌株需要依賴NAD才能生長，根據這一特性，最終確定其為生物Ⅰ型APP菌株。用12種常用抗生素對其進行了藥敏試驗，結果顯示，分離菌株對頭孢曲松、恩諾沙星、氨芐西林及復方新諾明4種藥物較為敏感，對鏈霉素具有較強的耐藥性。

豬傳染性胸膜肺炎的病理變化主要表現為肺部出血、壞死性支氣管肺炎、纖維素性胸膜炎和胸腔積液等，具有較高的致死性，近年來，此病在我國多處地方暴發，給我國畜牧業帶來了嚴重的經濟損失。因此PCP的防控顯得十分重要，現今疫苗防控和藥物防控是預防PCP的主要途徑。目前國內市場上針對PCP的疫苗主要為滅活疫苗，PCP滅活疫苗在臨床上的應用并不普遍， 即使PCP發病嚴重的豬場對疫苗的選擇也多舉棋不定，再加上臨床生產實踐中抗生素的濫用，APP的耐藥性問題也越來越嚴重，這給本病的防控增加了難度。廣大的養殖戶可以了解當地菌株的流行情況及血清型，從而制備合適的血清型疫苗進行免疫接種，并且將當地流行株的耐藥情況了解清楚，選擇合適的藥物防治該病。