氟苯尼考的應用及其毒副作用

胡東方 ， 孟凡亮 ， 銀 梅 ， 葛亞明 ， 劉思當

(1.河南科技學院動物科技學院 ， 河南 新鄉 453003 ； 2.山東農業大學動物科技學院 ， 山東 泰安 271018)

氟苯尼考(Florfenicol，FLO)又稱氟甲砜霉素，是氯霉素類的第3代廣譜抗菌藥物。該藥最初上市時主要用于水產養殖業細菌性疾病的防控；隨后，FLO迅速在多個國家被批準應用于魚類疾病、牛呼吸系統細菌性疾病等的防治；在有些國家也被準許添加在畜禽日糧中，以達到提高飼料轉化率及促生長等作用[1-2]。作為新一代動物專用的廣譜抗菌藥，FLO具有抗菌譜廣、吸收好、體內分布廣、安全高效等特點，我國在2000年就通過了FLO作為二類新獸藥的審批。近10多年來，FLO被越來越多的應用到我國獸醫臨床和水產養殖業，生產企業和產量也在不斷增加。據統計，截至2017年底，我國共有FLO獸藥生產批準文號6 600余個，生產企業幾千家，且目前全國FLO原料藥的銷售量已達1 000余噸，表明FLO在我國畜禽及水產動物細菌性疾病防控過程中發揮著舉足輕重的作用[3]。

1 抗菌機理

由于氯霉素會導致機體發生嚴重的不良反應，如再生障礙性貧血，目前在全球范圍內該藥在食品動物生產中已被禁止使用。以甲磺酰基(CH3SO2-)取代芳香環上的對位硝基(-NO2)而合成的甲砜霉素，便有效消除了氯霉素致再生障礙性貧血的風險；而進一步將甲砜霉素分子中C3的羥基(-OH)用氟原子(-F)取代生成FLO(圖1)后發現，該舉措可有效降低細菌乙酰轉移酶對此位置的乙酰化作用，從而降低了藥物被細菌酶降解的程度，增強了藥物對氯霉素及甲砜霉素耐藥菌株的抗菌活性[4]。

圖1 3種氯霉素類藥物的分子結構

FLO屬于一種抑制細菌蛋白質合成的藥物，可以顯著抑制革蘭陽性菌和陰性菌，與氯霉素及甲砜霉素的抗菌機制相近。FLO進入細菌菌體后可以和細菌核糖體50S大亞基上的A位點緊密結合，從而影響肽鏈延長過程中肽酰轉移酶的轉肽反應，使肽鏈的延長終止，最終起到抑制細菌蛋白質生成和抗菌的目的[2]。并且由于FLO分子中的α-OH被取代，使得FLO對細菌耐藥酶的耐受性大幅提高，所以該藥對氯霉素和甲砜霉素耐藥的細菌也具有良好抗菌活性[4]。

2 臨床應用

FLO起初被用于水產養殖業細菌性疾病的防控，對殺魚巴斯德菌、遲鈍愛德華菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌等絕大多數革蘭陰性和陽性的魚、蝦、蟹、貝類致病菌呈高度抗菌活性[5]，且FLO對常見致病菌的體外最低抑菌濃度一般在0.3～1.6 μg/mL[6]。在畜禽疾病防控方面，FLO曾被廣泛應用與豬、禽、牛、羊等動物的細菌性疾病防控。在豬病臨床，FLO已被大量使用于由巴氏桿菌引起的豬肺疫、豬萎縮性鼻炎及胸膜肺炎放線桿菌等引起的呼吸系統疾病。在家禽方面，主要應用于大腸桿菌病及傳染性漿膜炎等敏感菌所致疾病[1]。另外，FLO注射液也被用于治療各種年齡牛的呼吸系統細菌性疾病及腐蹄病。總的來說，FLO與其他常用抗菌藥物相比，對常見畜禽及水產動物致病菌有著較強的抗菌活性；同時，FLO對耐氯霉素和甲砜霉素的大腸桿菌、沙門菌及克雷伯菌等亦有良好抗菌作用。

近來研究表明，FLO除了具有抗菌作用外，還能夠抑制多種炎癥因子的產生并抑制機體的炎癥反應。鄧旭明教授團隊研究發現，FLO能夠通過抑制NF-κB通路而降低由細菌脂多糖誘導的RAW264.7細胞及小鼠血清中TNF和IL-6的水平，并顯著提高內毒素血癥小鼠的成活率[7-8]。此外，按照100 mg/(kg·bw)的劑量口服FLO后，對脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠具有明顯保護作用，主要表現在給藥小鼠肺臟水腫的比例和程度均明顯下降，且肺組織中及支氣管灌洗液中炎性細胞浸潤程度明顯降低；FLO通過對Th2型細胞因子的產生及炎性細胞浸潤程度的抑制，可顯著改善由卵白蛋白誘導的哮喘小鼠的呼吸功能[9]。以上研究表明，FLO除可作為抗菌藥用于細菌性疾病的治療外，在敗血性休克及呼吸系統炎癥的防治方面也具有潛在的應用價值。

3 毒副作用

FLO與前兩代藥物相比，具有更高的藥物安全性和抗菌效率，自上市之初至今，一直被作為獸醫臨床及水產養殖業中的明星藥物，應用范圍廣、應用量大。但近年來關于FLO毒副作用的報道也越來越多，主要表現在以下幾個方面。

3.1 免疫毒性 截至目前，FLO的諸多毒副作用中以免疫毒性的報道最多。最早關于FLO免疫毒性的報道可追溯至1987年，報道指出，與相同劑量的氯霉素相比，FLO可以顯著抑制中性粒細胞對金黃色葡萄球菌的吞噬作用[2]。Khalifeh等(2009年)發現20 mg/(kg·bw)的FLO連用5 d可顯著抑制雞新城疫疫苗特異性抗體的生成，表明FLO抑制了肉雞的體液免疫反應[10]。Chrzastek等(2011年)發現治療劑量的FLO并未造成2日齡肉仔雞法氏囊組織結構的顯著變化，但是對法氏囊皮質和髓質中Bu-1+細胞的分布卻產生了顯著影響，表現在皮質中Bu-1+細胞比例升高和髓質中比例下降，流式細胞術檢測結果表明，FLO處理組法氏囊Bu-1+細胞的數量下降了近9%，表明B細胞的成熟受到了FLO的抑制[11]。Guan等(2011年)在小鼠體內分別研究了FLO對口蹄疫疫苗及卵白蛋白免疫效果的影響，結果表明，FLO可顯著抑制脾細胞的增殖活性，同時降低脾臟中CD19+B細胞的數目，高劑量時對CD3+T細胞的數目也產生明顯影響；此外，FLO顯著抑制了口蹄疫病毒及卵白蛋白的特異性抗體如IgG、IgG1和IgG2b的產生，表明FLO對小鼠的體液免疫水平和細胞免疫水平都有抑制作用[12]。而Lunden等(2000年)在研究抗生素對虹鱒魚的免疫毒性時發現，治療劑量的FLO連續處理10 d后，可以顯著降低虹鱒魚頭腎淋巴細胞的增殖活性，且虹鱒魚T細胞比B細胞更易受到FLO的影響[13]。Lis等(2011年)研究發現，FLO可顯著降低小鼠外周血中白細胞、中性粒細胞及單核細胞的數量，同時抑制由SRBC免疫小鼠的體液免疫應答能力[14]。我們前期研究發現，保育豬在免疫豬瘟病毒疫苗后按照50 mg/(kg·bw)的劑量連用7 d FLO，可導致脾臟及胸腺發生明顯的結構損傷，主要表現在脾臟白髓和胸腺皮質區結構疏松、淋巴細胞數量下降，同時，豬瘟疫苗特異性抗體水平也受到了影響，但是在停藥后2周左右即可恢復正常，表明FLO可導致保育豬發生暫時性的免疫器官結構損傷和體液免疫抑制[15]。我們也在小鼠上對3種氯霉素類藥物的免疫毒性進行了比較病理學研究，結果表明，3種藥物均可導致胸腺及脾臟發生萎縮和結構損傷，其中以FLO導致的損傷作用最為嚴重；此外，藥物處理后脾細胞發生了細胞周期阻滯和增殖活性下降，細胞凋亡比例也明顯升高[16]。總的來說，FLO可造成免疫器官損傷，對不同動物均呈現出不同程度的體液免疫和細胞免疫抑制作用，其中以體液免疫抑制為主，但具體機制尚不明確。

3.2 胚胎發育毒性 除免疫毒性外，FLO導致的另一嚴重毒副作用即胚胎發育毒性。報道指出，按照10 mg/(kg·bw)飲水給予蛋雞FLO 5 d后發現，蛋雞所產受精蛋的孵化率降低了80%，而且FLO對孵化率的影響一直持續到停藥后1周左右[17]。Al-Shahrani等(2015年)進一步研究發現，使用90 mg/(kg·bw)的FLO連續飼喂公雞或母雞5 d后，給藥雞并未出現中毒癥狀；單獨對公雞飼喂FLO也不影響種蛋的孵化率，但是單獨對母雞飼喂后則可明顯降低種蛋的孵化率，與未給藥組相比降幅高達70%；在此過程中，雞胚主要在發育早期發生死亡，并以入孵5 d內死亡為主；當停藥4 d后，母雞所產受精蛋的孵化率即恢復正常。結果表明，FLO對入孵早期的雞胚具有胚胎發育毒性，而對采食FLO的公雞或母雞并無明顯毒性效應[1]。此外，據Schering-Plough公司數據顯示，給大鼠按照12 mg/(kg·bw·d)的劑量連續飼喂90 d FLO后發現，大鼠的附睪重量顯著減輕，同時母鼠的泌乳性能受到影響，子代大鼠的成活率也明顯降低；對妊娠6～15 d的孕小鼠灌胃給予400 mg/(kg·bw)的FLO可亦導致胚胎死亡[1]。而截至目前，FLO所致胚胎發育毒性的機制尚不明確。

3.3 其他毒副作用 FLO在水產養殖過程中也被作為最常用的抗菌藥物之一，因此，眾多學者也就FLO對水生動物的安全性進行了研究。Gaikowski等(2013年)研究發現，正常劑量或5倍劑量的FLO對羅非魚并無致死性，但會導致飼料消耗降低及體重減輕，且會導致魚鰓發生結構損傷和功能異常，肝內糖原型和脂類型肝細胞空泡增多，淋巴細胞減少及前腎細胞壞死增加等病變，表明FLO對羅非魚具有非致死性的毒副作用[5]。Botelho等(2015年)以幼齡羅非魚為對象研究了FLO的基因毒性，其結果表明，FLO可導致羅非魚紅細胞發生核異常，彗星實驗結果顯示FLO導致魚紅細胞發生了嚴重的DNA損傷，而具體機制尚不明確[18]。Ren等(2017年)以梭子蟹為對象研究了FLO的毒副作用，結果顯示，FLO可顯著抑制肝胰腺的抗氧化水平，FLO同時誘導了梭子蟹解毒基因及相應酶的高表達；高劑量的FLO導致生物分子發生氧化應激損傷[19]。

4 毒副作用機制

研究表明，古細菌在長期進化過程中與其寄生的宿主細胞達成了互利共生狀態，最終演化成了線粒體[20]。線粒體大約含有1 500種蛋白質，其中線粒體基因組(mtDNA)編碼了13種參與氧化磷酸化的酶類，其他大部分蛋白質由核基因組(nDNA)編碼，并轉運到線粒體。其中，mtDNA編碼的蛋白質由線粒體核糖體翻譯，而nDNA編碼的蛋白質則由細胞質核糖體翻譯。緣于線粒體核糖體與細菌核糖體在起源及結構上的相似性，故而許多靶向細菌線粒體的抗菌藥物在發揮抗菌作用的同時便不可避免地抑制了真核細胞線粒體核糖體的翻譯功能。正常情況下，這些nDNA編碼的線粒體蛋白質和mtDNA編碼的多肽/蛋白質進行同步的、配套的翻譯后折疊、組裝過程，進而形成線粒體呼吸鏈復合體。在此過程中，如果由nDNA和mtNDA編碼的線粒體蛋白質發生比例失衡，造成線粒體呼吸鏈復合體不能正確組裝，則會造成線粒體的蛋白毒性應激和代謝應激[21]。當線粒體受到如蛋白毒性、滲透性變化及氧化應激等的影響而發生線粒體應激反應時，細胞內多種由線粒體到細胞核的信號轉導通路如線粒體生物合成、線粒體自噬及線粒體未折疊蛋白反應等能夠活化以緩解線粒體應激并維持線粒體功能。而當這些通路發生慢性、持續性活化后，則會導致線粒體毒性及功能異常。而越來越多的研究證實，線粒體除了為細胞供能外，還參與諸如鈣穩態、生熱作用、類固醇生成、解毒作用、炎癥反應、氧化應激及細胞死亡等諸多生命活動過程并發揮重要調節作用[22]，因此線粒體損傷在FLO誘導的機體毒副作用中應該發揮重要作用。目前已報道的可造成線粒體損傷并引發機體毒副作用的抗菌藥物包括氨基糖苷類藥物、四環素類藥物、大環內酯類藥物及氯霉素等[23-24]。我們前期在細胞水平研究了FLO對線粒體結構與功能的影響及線粒體損傷對細胞生命活動的影響，結果顯示， FLO可造成線粒體結構和功能損傷，并通過活化能量應激蛋白AMPK，激活mTOR/p70S6K信號通路；同時p53/p21通路也被活化，導致了細胞周期發生G0/G1阻滯和增殖抑制。此外，功能異常的線粒體導致胞內活性氧(ROS)升高，ROS引起的p53表達上調抑制了線粒體自噬蛋白Parkin向損傷線粒體的轉位過程，阻礙了線粒體自噬的進行，致使損傷線粒體在細胞內大量累積，進一步抑制了細胞增殖并誘發了細胞早衰[25]。盡管目前已經明確FLO對線粒體蛋白質合成及線粒體結構與功能的影響，但FLO造成機體毒副作用特別是免疫毒性和胚胎發育毒性的分子病理機制尚需深入研究。

5 展望

FLO作為目前獸醫臨床及水產養殖過程中適用范圍最廣、使用量最大的抗菌藥之一，在使用時應嚴格控制使用的時間和劑量，不能濫用，更不能亂用；應注意藥物的聯合使用及合理配伍，盡可能做到科學合理用藥并減少毒副作用及耐藥性的發生。需特別注意的是，由于本品具有胚胎毒性，妊娠期及哺乳期家畜應慎用，家禽在產蛋期應禁用；且本品具有造血免疫毒性，雖然不會引起再生障礙性貧血，但其引起的可逆性紅細胞生成抑制和免疫抑制作用比氯霉素更常見，疫苗接種期或免疫功能嚴重受損的動物宜禁用。此外，為進一步指導FLO的合理應用，并為新藥研發提供依據，深入研究和闡明FLO毒副作用的機制，特別是FLO所致的免疫毒性和胚胎發育毒性，將成為藥理學與毒理學領域新的課題。