包頭地區仔豬源致瀉性大腸桿菌進化分群、生物被膜形成能力及耐藥性檢測

葛海燕

(內蒙古農業大學職業技術學院 ， 內蒙古 包頭 014100)

仔豬腹瀉是臨床中常見疾病之一，其發病率和死亡率均較高，引起仔豬腹瀉病原較多，主要包括大腸桿菌、沙門菌、奇異變形桿菌、產氣莢膜梭菌、流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒等，其中致病性大腸桿菌是引發仔豬腹瀉的重要病原之一[1-3]。細菌生物被膜(Bacterial biofilm, BBF) 是組成結構性細菌群落的主要物質，主要由附著細菌細胞和包裹細菌的水合性胞外聚合物物質，在自然界中，當外界條件成熟，細菌均能夠形成生物被膜(Biofilm，BF)，生物被膜形成能力與細菌毒力及耐藥性具有一定相關性[4-5]。仔豬大腸桿菌病的防治主要以抗菌藥物為主，長期使用抗菌藥物，會致使大腸桿菌多重耐藥菌株不斷出現，降低抗菌藥物使用效果，同時也給人們健康帶來一定威脅[6-7]。

本試驗以臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌為研究對象，檢測并分析其進化分群、生物被膜形成能力、耐藥性及其相關性，為科學中合理用藥及防控該病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2018-2019年，臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌、大腸桿菌質控菌株 ATCC 25922均由本單位動物傳染病實驗室保存。

1.2 主要試驗材料 營養肉湯，購自北京雙旋微生物培養基制備科技公司；大腸桿菌顯色培養基，購自青島高科園海博生物技術有限公司；臨床中常用藥物紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；96孔細菌培養板，購自上海研晶生物科技有限公司；2×TaqMarker Mix，購自北京康為世紀生物科技有限公司；DL-600 Marker，購自北京中科瑞泰生物公司；細菌DNA提取試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；常規的試驗試劑由本試驗提供。

1.3 細菌的復蘇與培養 取出-80 ℃保存的菌種，室溫解凍，無菌條件劃線接種于大腸桿菌顯色培養基，37 ℃恒溫培養12～18 h，挑取大腸桿菌顯色培養基生長的單個菌落，接種于營養肉湯中擴大培養，并進行計數。

1.4 細菌分子分群PCR鑒定 參考文獻[8]，設計大腸桿菌分子分群chuA、yiaA和TspE4.C2引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按照細菌DNA提取試劑盒說明書提取分離菌株的基因組DNA，采用多重PCR方法對大腸桿菌進行系統分群鑒定，大腸桿菌系統分群進化判定標準見圖1。PCR反應體系25 μL：2×TaqMarker 12.5 μL，引物P1、P2各1 μL，DNA模板1 μL，去離子水9.5 μL。94 ℃預變性 5 min; 94 ℃變性 30 s, 57.5 ℃復性 30 s, 72 ℃延伸60 s，30個循環;最后 72 ℃延伸 5 min。將擴增后的 PCR 產物用1%瓊脂糖上凝膠電泳檢測目的條帶。

圖1 大腸桿菌系統進化分群的判定標準

表1 大腸桿菌分子分群引物序列

1.5 細菌的藥敏試驗檢測 參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)推薦的標準藥敏試驗法進行操作和試驗結果判斷，以大腸桿菌 ATCC 25922作為質控菌株。調整分離菌株的濃度為0.5個麥氏濁度，無菌條件下均勻涂布在普通營養培養基上，貼上藥敏紙片，37 ℃培養18～24 h，測量其抑菌圈直徑(mm)。

1.6 細菌的BF 檢測 按參考文獻[9]，采用結晶紫微孔板法對臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌進行 BF形成能力測定。每株菌重復接種 10孔，在OD值595 nm下，重復檢測試驗孔和對照孔3 次，取均值。判定標準以陰性對照孔OD值的2倍作為判斷能否形成 BF 的臨界點ODc值，當OD值≤ODc值時，表示BF形成能力為0；當ODc值

2 結果

2.1 細菌分子分群鑒定 分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌均擴出來chuA、yiaA和TspE4.C2目的條帶。經結果判定，48株仔豬源致瀉性大腸桿菌中，A群有8株、B1群有9株、B2群有17株、D群有12株，分別占分離菌株的16.7%、18.8%、35.4%、25.0%， 其中， B2群和D群流行為主(表2)。

表2 仔豬源致瀉性大腸桿菌系統進化分群鑒定結果

2.2 耐藥性檢測 由表3可知，分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶、多黏菌素、氟苯尼考、恩諾沙星7種藥物耐藥性較高，耐藥率在58.3%～100.0%；對頭孢噻呋、頭孢曲松、環丙沙星、林可霉素、大觀霉素5種藥物耐藥性相對較低，耐藥率在11.9%～31.3%。

表3 仔豬源致瀉性大腸桿菌的耐藥性分析結果

2.3 BF形成能力檢測 采用結晶紫微孔板法對臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌進行 BF形成能力測定。臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌中43株能形成BF，占分離菌株的89.6%(43/48)。其中，強形成膜能力菌株有 20株、中形成膜能力菌株有16株、弱形成膜能力菌株有7株、不形成BF菌株的有5株，分別占分離菌株的41.7%、33.3%、14.6%、10.4%。

2.4 BF形成能力與耐藥性相關性分析 由表4可知，多黏菌素、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林7種藥物耐藥性與強形成BF菌株的復合率在60.0%～100%，多黏菌素、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林7種藥物耐藥性與中形成BF菌株的復合率在56.3%～93.8%，多粘菌素、新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林5種藥物耐藥性與強形成BF菌株的復合率在57.1%～100%。其余的抗菌藥物的耐藥性與BF形成復合率較低。說明多黏菌素、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林7種藥物耐藥性產生與BF形成能力有關。

表4 仔豬源致瀉性大腸桿菌耐藥性與BF形成能力相關性分析結果

3 討論

已有報道表明，大腸桿菌可分為 A、B1、B2 和 D 四個群，其中 B2 和 D 群被認為是主要的致病群[8-9]。研究表明，分離的致犬腹瀉性大腸桿菌分離株以B2、D群為主。本試驗表明，48株仔豬源致瀉性大腸桿菌中以B2群和D群流行為主，分別占分離菌株的35.4%和25.0%，與王明誠等[10]報道的基本上一致。但與李金朋等[9]報道具有一定的差異性，可能與地區有關。

大腸桿菌耐藥性產生與抗菌藥物長期使用有關，還與其攜帶的耐藥機制有關，其攜帶耐藥質粒在不同菌株之間傳播，引起其他菌株產生耐藥性[11]。本試驗表明，該地區分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌對抗菌藥物耐藥性嚴重。與計徐等[12]、王克領等[13]的報道存在一定差異性。可能與地區、菌株耐藥性遺傳及臨床用藥不同，導致仔豬大腸桿菌產生耐藥性存在一定的差異性。本試驗表明，48株仔豬源致瀉性大腸桿菌的BF 形成能力與多黏菌素、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶等7種藥物耐藥性存在一定的相關性，說明仔豬源致瀉性大腸桿菌的BF 形成能力與其產生的耐藥性有關，其BF形成能力增加大腸桿菌的耐藥性。與李金朋等[9]報道基本上一致。BF形成能力增強細菌耐藥性機理尚未明確，有待進一步研究。本試驗為該地區仔豬源致瀉性大腸桿菌病臨床合理用藥提供了試驗依據。