狗棗獼猴桃多酚對60Coγ射線輻射損傷小鼠免疫系統保護作用的研究

左麗麗 ， 李昰奇 ， 富校軼 ， 高永欣 ， 王振宇 ， 王舒然

(1.吉林醫藥學院公共衛生學院 ， 吉林 吉林 132013 ; 2.哈爾濱工業大學化工與化學學院 ， 黑龍江 哈爾濱 150090)

隨著科技的不斷進步，輻射已經滲透到生活的各個領域，輻射造成的損傷日益嚴重[1-4]。輻射會導致機體產生大量的活性氧自由基，自由基攻擊DNA、蛋白質、脂質等生物大分子，從而產生一系列的鏈式反應，最終誘發機體的衰老、免疫力低下、炎癥、癌癥等一系列疾病。輻射防護劑普遍存在毒副作用，能夠誘導機體正常的器官和組織損傷，不宜長期服用。因此尋找高效、無毒或低毒、適宜人類長期服用的輻射防護劑是目前亟待解決的關鍵問題[5-8]。狗棗獼猴桃是東北地區的野生漿果，含有大量的活性成分。通過前期研究發現，多酚是狗棗獼猴桃果實中重要的功效成分，具有抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、提高機體免疫力等多種功能活性[9-11]。本文通過建立輻射誘導的氧化損傷模型，主要研究狗棗獼猴桃多酚在造血及免疫系統方面的輻射防護作用，旨在為其作為輻射防護劑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 狗棗獼猴桃野生漿果采摘于黑龍江省大興安嶺地區；狗棗獼猴桃多酚(AKP，純度38.6%)由哈爾濱工業大學化工與化學學院制備；清潔級雄性昆明系小鼠6～8周齡，體重(22±2)g，許可證號：SCXK(黑)2013-001，購自哈爾濱醫科大學腫瘤醫院動物實驗中心；利可君片由江蘇吉貝爾藥業有限公司生產；IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ試劑盒，均購自南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設備 HR2006型料理機，購自飛利浦電子香港有限公司；TDZ4-WS型低速離心機，購自湖南湘儀實驗儀器有限公司；Sp-752PC型紫外可見分光光度計，購自北京光譜儀器有限公司；RE-3000旋轉蒸發儀，購自上海亞榮生化儀器廠；KQ-5200超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司；FD-18真空凍干機，購自上海田楓實業有限公司；HT-2 酶標儀，購自Biocell公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠輻射損傷模型的建立60Coγ射線誘導的小鼠氧化損傷模型見文獻[11]，輻射后第2天摘眼球取血，脫臼處死小鼠，迅速剝離小鼠的肝、脾等組織，放置在4 ℃預冷的生理鹽水中清洗3次，去除血污及其結締組織，然后用濾紙將臟器表面的水分充分吸干，稱重并記錄數據。

1.2.2 外周血白細胞計數 準確吸取380 μL白細胞稀釋液加入20 μL血液，充分混勻后，吸取少量白細胞混懸液滴入血球計數板計數池內，靜置2～3 min，待白細胞沉降后進行計數分析。在低倍鏡下觀察，白細胞近似成圓形，胞漿透亮，細胞核呈現紫黑色，并稍有折光。計數是計數池四角的4個大方格中所有的白細胞數。按照公式(1)進行計算：

I=A/4×N×107

(1)

I:白細胞數目(個/L)；A:4個大方格中所有的細胞數；N:稀釋倍數

1.2.3 碳廓清試驗 小鼠輻射24 h后，將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋5倍后，按照0.1 mL/(10 g·bw)，從尾靜脈緩慢注入稀釋好的印度墨汁，待墨汁注射完畢，用秒表立即開始計時。注射墨汁結束后的2 min、10 min，使用預先用抗凝劑處理好的毛細管分別從小鼠眼眶靜脈叢取血20 μL，立即將其加入到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，在600 nm波長下測定吸光度值。隨后將小鼠脫臼處死，立即剖檢取其肝臟和脾臟，清洗血污，稱重并記錄數據。按照公式(2)、(3)分別計算吞噬指數及校正吞噬指數，以此來表示機體吞噬細胞的吞噬能力[12-13]。

吞噬指數k=(lgA1-lgA2)/(t2-t1)

(2)

校正吞噬指數a=體重×k1/3/(肝重+脾重)

(3)

k：直線斜率，表示吞噬速率；a：反應每單位組織重量的吞噬活性；A1:t1血標本的吸光度值；A2:t2血標本的吸光度值；t1:注入墨計后第1次采集血標本的時間；t2:注入墨計后第2次采集血標本的時間。

1.2.4 細胞因子白介素的測定 脾淋巴細胞懸浮液的制備[14]：在無菌條件下剖檢小鼠取出脾組織，將其放置到盛有適量的無菌Hank′s液培養皿中，使用鑷子將脾組織輕輕磨碎，制成單細胞懸浮液。然后使用200目篩網過濾細胞，用Hank′s液充分洗滌細胞2次，每次以1 000 r/min的速度離心10 min。然后將細胞懸浮于1 mL的新鮮培養液中，用臺盼藍對其進行染色并記錄活細胞數量(應在95%以上)，最后調整細胞濃度為2×106個/mL左右。按照1 mL/孔的量加入到24孔培養板中，并設置3個重復，每孔加入50 μL的Con A(終濃度為7.5 μg/mL)，置于37 ℃、5%的CO2培養箱中培養72 h，離心收集上清液測定其中細胞因子含量[15-17]。細胞因子白介素IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的測定按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計與分析 每組進行3次平行試驗，數據以平均值±標準差表示，采用Original 8.5進行統計分析。

2 結果

2.1 AKP對外周血白細胞數量的影響 機體經過γ射線照射后，會造成體內白細胞數量出現不同程度降低，從而導致機體對抗外界細菌入侵的能力下降[18]。通過白細胞計數發現，輻射后模型組與對照組相比白細胞數極顯著降低(P<0.01)，如圖1所示，給藥陽性對照組白細胞得到一定程度的恢復，AKP給藥組使白細胞的數量都有顯著上升趨勢，隨著AKP濃度的升高，低、中劑量組白細胞數也逐漸升高，中劑量組的升高趨勢超過了陽性對照利可君片組，但高劑量組相比模型組也有升高，但不及中、低劑量組。因此，AKP具有很好的增加白細胞的能力，提高機體的免疫力。

圖1 AKP對輻射小鼠外周血白細胞的影響

2.2 AKP對白細胞中不同細胞形態變化的影響 顯微鏡下白細胞的形態變化，如中插彩版圖2所示，白細胞主要包括粒細胞和淋巴細胞，空白對照組體內細胞正常，細胞膜完整清晰可見，當輻射后，細胞受到不同程度的傷害，分葉細胞內部會出現空泡，細胞膜破裂，淋巴細胞也會出現異型，顯示出輻射對機體造成了損傷。每個片子隨機計數100個白細胞，并記錄不同形態的細胞數。如圖3所示，氧化傷害后模型組損傷的細胞數顯著增加，而AKP和利可君片加藥組能夠明顯降低白細胞的損傷程度，對粒細胞和淋巴細胞的完整性都起到不同程度的防護作用。

圖3 外周血白細胞計數分析各類細胞損傷情況

2.3 AKP對小鼠胸腺指數和脾臟指數的影響 胸腺是生物體重要的中樞免疫器官，同時也是T細胞發育及分化的主要場所，它的功能是介導細胞免疫，調節機體的免疫功能[19-20]。γ-射線照射小鼠，根據其體重、脾臟和胸腺的質量分別計算脾臟指數和胸腺指數，結果如表1所示。與正常對照組相比，機體受到輻射后脾臟指數和胸腺指數極顯著降低(P<0.01)，這表明脾臟和胸腺受到嚴重的損傷，導致免疫器官細胞的損傷或凋亡。與模型組相比，給藥組利可君片使脾臟和胸腺指數極顯著提高(P<0.01)，AKP不同濃度的劑量組也不同程度的提高了小鼠的脾臟指數和胸腺指數，且中劑量組效果最佳，但是不及利可君片組。因此，AKP和利可君片均可提高輻射小鼠的脾臟指數和胸腺指數，減少輻射對機體造成的損傷，同時在一定程度上也促進了免疫器官的恢復。

表1 狗棗獼猴桃多酚對小鼠脾臟指數和胸腺指數的影響

2.4 AKP對巨噬細胞吞噬能力的影響 非特異性免疫是機體免疫系統重要的組成部分，單核巨噬細胞的吞噬能力能夠有效反映動物的非特異性免疫功能。小鼠尾靜脈注射印度墨汁，其碳粒迅速被肝臟、脾臟等器官內皮網狀細胞吞噬而使其血漿濃度下降，因此，其廓清速率間接反映單核巨噬細胞系統的吞噬功能[19]。由表2可以看出，輻射后模型組吞噬指數明顯降低，與正常對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)，表明該組中小鼠的免疫功能受到嚴重的抑制，利可君片組以及灌胃AKP的低劑量組吞噬指數顯著升高(P<0.05)，中劑量和高劑量組與模型組相比吞噬指數也有顯著提高，碳廓清指數與模型組比較有顯著的改善(P<0.05)，但低于正常對照組，且中、高劑量組之間差異不顯著，即AKP能夠增強巨噬細胞的吞噬功能，加速對碳粒的清除。

表2 狗棗獼猴桃多酚對小鼠吞噬指數的影響

2.5 AKP對輻射誘導的小鼠脾淋巴細胞形態的影響 淋巴細胞是對輻射非常敏感的器官，一旦受損就會導致機體的免疫力下降[15,20]。圖4顯示顯微鏡下觀察到空白對照組脾淋巴細胞為圓形或橢圓形，邊緣整齊，大小均一。輻射后脾淋巴細胞數量變少，細胞多呈不規則形，胞膜邊緣不整齊，染色質粗糙，呈粗網狀或成堆排列，細胞內超微結構發生變化，機體的免疫力急劇下降。輻射前給予機體不同濃度的AKP能夠顯著的改善脾淋巴細胞的形態，低、中劑量組隨著濃度的升高脾淋巴細胞的數量也逐漸增多，細胞的形態也趨于正常化，中劑量組優于高劑量組。而利可君片組能夠使脾淋巴細胞的數量和形態基本恢復正常化，引起脾淋巴細胞以及DNA、RNA含量的增加，這表明AKP和利可君片均能夠有效提高機體的免疫力。

圖4 脾淋巴細胞的形態(40×)

2.6 AKP對白介素IL-2生成能力的影響 IL-2主要激活CD4+T1細胞的產生，又稱作T細胞生長因子，能夠引起T細胞的增殖，使T細胞激活并進入分裂狀態，而T細胞的活化又抑制機體的特異性免疫應答[15]。IL-2的標準曲線方程為y=0.002 44x-0.012 48，R2=0.999 84，脾淋巴細胞中IL-2的含量如圖5所示，輻射后模型組小鼠的脾細胞中IL-2的含量顯著降低(P<0.01或P<0.05)，輻射前灌胃不同劑量的AKP和利可君片能夠顯著促進脾淋巴細胞中IL-2細胞因子的分泌，與模型對照組相比，存在顯著性的差異，并隨著給藥劑量的增加，機體IL-2的分泌量也不斷升高，尤其是對高劑量組脾細胞中IL-2的作用更顯著，存在著明顯的劑量效應關系。

圖5 AKP對小鼠脾細胞中IL-2生成能力的影響

2.7 AKP對白介素IL-4生成能力的影響 IL-4被認為是典型的由Th2細胞產生的細胞因子，隨著IL-4的激活，Th2細胞隨后產生附加的IL-4[21]，對于T、B淋巴細胞的發育以及調節體液免疫和適應性免疫起關鍵作用[22-23]。IL-4的標準曲線方程y=0.001 19-0.032 89x，R2=0.995 01，輻射損傷后小鼠脾淋巴細胞中IL-4的含量如圖6所示，輻射后機體脾淋巴細胞中IL-4的含量有少量的降低，灌胃不同劑量的AKP和利可君片可促進機體脾淋巴細胞中IL-4的分泌，但提高不顯著，只有高劑量的AKP顯著提高了脾淋巴細胞中IL-4的含量，其他劑量組之間也沒有顯著性差異。這表明AKP對機體分泌IL-4因子的效果不顯著。

圖6 AKP對小鼠脾淋巴細胞中IL-4生成能力的影響

2.8 AKP對白介素IL-10生成能力的影響 IL-10是抗炎因子，是幾個免疫反應重要的調節器。IL-10的標準曲線線性方程y=8.831 17E-4x+0.083 52，R2=0.998 6，輻射后小鼠脾淋巴細胞中IL-10的含量如圖7所示，輻射后小鼠脾淋巴細胞中IL-10的含量極顯著降低(P<0.01)。灌胃AKP能夠有效的提高機體中IL-10的含量，從而增加機體的免疫水平。利可君片沒有提高脾淋巴細胞中IL-10的含量，而中、高劑量組的AKP能夠顯著的促進IL-10的分泌，但是與正常對照組之間還存在一定的差異(P<0.05)。

圖7 AKP對氧化損傷小鼠脾淋巴細胞中IL-10生成能力的影響

2.9 AKP對干擾素IFN-γ生成能力的影響 IFN-γ可誘導細胞因子的產生、上調Fc受體和白血細胞粘附因子等的表達。IFN-γ通過與其特異性的細胞表面受體高親和力的結合，而發揮生物學活性[24-25]。IFN-γ標準曲線線性方程y=0.003 3x+0.115 54，R2=0.994 46。輻射后小鼠脾淋巴細胞中IFN-γ的含量，如圖8所示，輻射導致機體脾淋巴細胞中IFN-γ的含量極顯著降低(P<0.01)，灌胃不同劑量的AKP和利可君片后機體內IFN-γ的含量不同程度的提高，但是組間沒有顯著性差異，且相對于正常對照組也還有一定的差異，這表明AKP促進了機體中IFN-γ的分泌，顯著提高機體的免疫能力。

圖8 AKP對氧化損傷脾淋巴細胞中IFN-γ生成能力的影響

3 討論

已有研究表明，輻射后機體的各個系統、器官以及組織都有可能受到損傷，其中造血組織最為敏感，造血組織損傷是機體最早出現的基本損傷之一[26-27]。射線會對機體的造血系統產生影響，射線作用于骨髓造血干細胞，使得細胞增殖能力下降，造血功能受阻，最直接的表現為外周血象降低[28-29]。本試驗結果顯示，輻射導致小鼠外周血白細胞數量急劇減少，白細胞損傷嚴重，AKP的低、中、高劑量組使得輻射小鼠血液白細胞有一定程度的恢復，且分葉帶空泡粒細胞和破碎細胞的數量減少，表明AKP對造血系統有一定的保護作用。

胸腺和脾臟是機體2個重要的免疫器官，因此,動物試驗中脾臟指數和胸腺指數廣泛被用來作為免疫功能指標進行檢測。張成強等研究顯示，輻射導致小鼠脾臟和胸腺指數顯著降低，而葡萄籽多酚和藍莓多酚能夠明顯改善輻射小鼠的胸腺指數，并對脾臟指數有一定程度的提高[30]。本試驗也發現，AKP低、中、高劑量組的胸腺指數和脾臟指數均高于模型組，且中劑量組效果最好，提示AKP能夠保護胸腺和脾臟，也就是說，AKP對免疫系統有一定的保護作用。另外，對單核巨噬細胞吞噬功能的影響研究也提示，AKP有提高輻射小鼠免疫功能的作用，從而進一步保護輻射小鼠形成免疫抑制等現象。

細胞因子是一類由活化的免疫細胞(淋巴細胞以及單核巨噬細胞)和相關細胞產生的具有調節細胞功能的高活性、多功能蛋白質多肽分子或糖蛋白，是免疫系統重要的信息分子，在免疫調節中充當重要的角色。程翠林的研究發現,輻射后小鼠脾淋巴細胞免疫因子(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ)出現不同程度的下降[31]。本試驗也發現相同的結果，攝入不同濃度的AKP均能提高由刀豆蛋白刺激的輻照小鼠脾淋巴細胞的增殖與轉化，并可以顯著提高小鼠脾臟中IL-2的分泌，誘生IFN-γ，促進T、B淋巴細胞的分化以及細胞毒性T淋巴細胞成熟，增強小鼠機體細胞免疫能力，同時促進IL-10的分泌，下調免疫抑制，維持機體的健康，即AKP通過促進體內細胞因子的分泌，特定的激活細胞調節的免疫反應，從而有效的提高機體的免疫力。初步證實了AKP對輻射誘導的免疫損傷具有一定的保護作用，為其進一步開發及應用提供了科學依據。