基于超高效液相色譜-離子阱-飛行時間質譜聯用的白血病細胞及耐藥細胞非靶標代謝組學研究

周玲婳，盧紅梅

(中南大學 化學化工學院，湖南 長沙 410083)

白血病是一種因造血干細胞在分化過程中不同階段發生凋亡障礙、分化阻滯以及惡性增殖而引起的異質性造血系統惡性腫瘤。根據臨床和病理情況，一般將白血病分為慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性髓系細胞白血病、急性髓系細胞白血病和其它少見的白血病類型。白血病的主要治療方式為多種藥物結合化療和骨髓移植，而多藥耐藥性是治療中的最大障礙之一。白血病多藥耐藥性的形成機制十分復雜，目前許多報道從相關基因[1-3]、蛋白質[4-5]和代謝物[6-8]等多方面進行研究。其中，代謝組學作為一門致力于研究整個生物體的動態代謝狀態的“組學”，具有以下優點：①所需檢測的代謝產物數量遠少于基因和蛋白質的數量；②基因和蛋白水平的微小改變會在代謝產物中被放大；③檢測對象是代謝的最終產物，能夠直接反映機體的生理或病理狀態[9-10]。這些優點使得代謝組學廣泛用于各種疾病的代謝研究。

目前，液相色譜-質譜聯用(LC-MS)因具有靈敏度高、分辨率高、穩定性好、干擾小等優點，而成為細胞代謝物研究的最熱門分析手段之一。由于細胞中各種酶反應活躍且繁多，代謝產物成分復雜，濃度跨度大，物質之間理化性質差異較大，所以最大限度地提取細胞內代謝物是非靶標分析方法的關鍵步驟。細胞猝滅是進行細胞內代謝物分析前的最重要步驟，Dietmair等[11]比較了60%甲醇、含0.9%碳酸氫銨(AMBIC)的60%甲醇和0.9% NaCl溶液3種常用的猝滅溶劑，發現0.9%的NaCl溶液對哺乳動物細胞有較好的猝滅效果，并通過比較12種溶劑體系對中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的提取結果，發現50%乙腈水溶液的效果最好。He等[12]基于氣相色譜-質譜聯用比較了100%甲醇、甲醇/甲醇/水(2∶2∶1,體積比)、50%乙腈水溶液和60%甲醇水溶液4種提取溶劑的提取效率，發現甲醇/甲醇/水的提取效果最好。Liu等[13]發現80%甲醇對人結腸腺癌(HCT8)細胞的代謝物提取最多。所以，對不同類型的細胞分析時，應優化出最合適的溶劑提取方法。除了溶劑提取外，利用物理化學或機械作用力，如超聲、凍融、微波[14]等方法進行細胞破碎，可幫助提高胞內代謝物的提取效率。

本實驗采用超高效液相色譜-離子阱-飛行時間質譜(UPLC-IT-TOF MS)聯用分析平臺，以人慢性髓系白血病細胞及其阿霉素耐藥細胞(K562和K562-ADM)制備成的質量控制(QC)樣本為研究對象，以獲得的代謝特征峰數目和方法重復性等為評價指標，分別考察了細胞破碎方法、提取溶劑體系以及溶劑體積對提取效果的影響，以期建立可靠的研究2種細胞代謝物差異的非靶標代謝組學分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-質譜聯用儀：LC-30AD超高效液相色譜系統、Shimadzu LCMS-8050離子阱-飛行時間質譜儀(Shimadzu公司)；高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀科學儀器有限公司)；KQ3200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HSC-24A氮吹儀(南京科捷分析儀器有限公司)；AL104電子分析天平(Mettler-Toledo公司)；加熱/制冷型-TCS10恒溫混勻儀(杭州瑞城儀器有限公司)；IKA MS 3digital渦旋儀(北京聯合科儀科技有限公司)。

甲酸、甲醇、乙腈和異丙醇(HPLC級，德國Merck公司)；純凈水(杭州娃哈哈公司)；氯仿(優級純，科隆化工試劑廠)；甲基叔丁基醚(優級純，上海泰坦科技股份有限公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries)；RPMI 1640培養基(美國Hyclone公司)。標準品：L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-精氨酸、L-肉堿和馬尿酸均購于美國Sigma公司。

1.2 細胞的培養與收集

人慢性髓系白血病細胞(K562細胞株)及其阿霉素耐藥細胞(K562-ADM耐藥細胞株)均來自中南大學湘雅醫學院。

K562和K562-ADM細胞常規培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基(37 ℃，5%CO2)中。K562-ADM細胞培養于含阿霉素(300 ng/mL)的培養基中直至細胞收集前1周。

當細胞處于指數生長期時，用血細胞計數器計算培養基中細胞的密度，從而計算收集每個樣本所需的細胞懸浮液體積(V1)。采用液氮和5V1的9 g/L NaCl(4 ℃)溶液進行猝滅。

1.3 樣本預處理

將K562和K562-ADM細胞等量混合后，等分為200個QC樣本(每個QC樣本中細胞數量為2×106)。以QC樣本進行細胞破碎方法、提取溶劑體系和提取溶劑體積的條件考察后，得到優化的樣本預處理步驟如下：

向QC樣本中加入10 μL的馬尿酸(5.34 μg/mL，內標)和400 μL的80%甲醇(-20 ℃預冷)，渦旋1 min后，置于超聲清洗儀中超聲7.5 min，通過加冰維持水溫為4 ℃。在4 ℃下16 000 r/min離心10 min后，將上層代謝物提取液轉移至置于干冰上的玻璃離心管中。剩余物質再用400 μL的80%甲醇(-20 ℃預冷)重復上述步驟，收集代謝物提取液，氮吹至完全干燥，復溶于100 μL 80%甲醇(5%甲酸，體積分數，下同)中，離心10 min(16 000 r/min，4 ℃)，取上層清液于進樣瓶中，進樣分析。

1.4 儀器條件

液相色譜條件：ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters 公司)，柱溫為35 ℃，自動進樣器溫度為4 ℃，進樣量為4 μL。流動相：A相為含0.1%甲酸的水溶液，B相為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫條件：0～3 min，5% B；3～4.5 min，5%～50% B；4.5～15 min，50%～100% B；15～25 min，100% B。流速在0～19 min時為0.30 mL/min；19～20 min，0.30～0.35 mL/min；20～25 min，0.35 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源正離子模式，CDL管的溫度為200 ℃，霧化氣(N2)流速為1.5 L/min，干燥氣(N2)壓力為100 kPa，離子阱壓力為1.8×10-5kPa，檢測器電壓為1.62 kV,噴霧電壓為+4.5 kV，RP真空度為85.0～92.0 Pa，IT真空度為1.8×10-2Pa，TOF真空度為1.3×10-4Pa。前處理條件優化時采用質譜全掃描模式，掃描范圍為m/z100～1 000；后續對差異代謝特征定性時進行MS/MS數據采集，掃描范圍為m/z50～1 000。

1.5 數據處理與統計分析

將UPLC-MS獲得的原始數據從工作站轉換為MADATA格式的文件，再將文件導入MZmine 2.0軟件[15]進行峰提取、同位素峰合并、峰值積分、峰對齊，生成包含保留時間、質荷比和面積的數據矩陣，按80%規則[16]去除零值，并以內標法進行校準后，數據矩陣導入MetaboAnalyst 4.0(https://www.metaboanalyst.ca/)中。對數據進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，并進行雙尾t檢驗和對p-value采用Benjamini-Hochberg方法進行錯誤發現率(FDR)校正，以得到的校正p值和2組數據平均值的倍數變化(FC=平均值(K562強度)/平均值(K562-ADM 強度))，確定其是否具有顯著性差異。

通過代謝特征的準確質荷比以及MS/MS碎片信息，結合儀器工作站的Formula Predictor軟件，在METLIN(http://metlin.scripps.edu/)和HMDB(http://www.hmdb.ca/)數據庫中搜索推測可能的結構式，部分代謝特征進行標準品比對鑒定。

1.6 方法學考察

儀器穩定性：按“1.3”方法處理QC樣本，同一QC樣本連續進樣6次，計算代謝特征峰強度的相對標準偏差(RSD)，考察儀器穩定性。

方法重復性：按“1.3”方法平行處理6份樣本，連續進樣，計算代謝特征峰強度的RSD，考察方法重復性。

日內精密度：按“1.3”方法平行處理 QC樣本，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12 h進樣分析，計算代謝特征峰強度的RSD，考察日內精密度。

2 結果與討論

2.1 樣品處理方法的優化

2.1.1 細胞破碎方法的優化以甲醇為提取溶劑，考察了超聲和凍融循環2種常見的細胞破碎方法對細胞代謝物提取的影響。其中凍融循環破碎方法的步驟如下：樣本加入提取溶劑，渦旋1 min后，在液氮中放置10 min，然后在37 ℃的恒溫混勻儀中振蕩5 min，凍融步驟重復3次，離心后，轉移提取代謝物至干凈的玻璃離心管中，溶劑提取循環3次。超聲破碎方法見“1.3”。每種方法處理6個平行樣。對實驗得到的2組數據進行處理，以代謝特征峰數目、相同代謝特征峰的平均強度和RSD為指標，對不同的細胞破碎方法進行評價。

結果顯示，凍融循環破碎和超聲破碎方法得到的代謝特征峰數目分別為(514.17±2.32)和(556.33±6.28)(圖1A)。兩種方法檢測到330個相同的代謝特征峰(圖1B)，其中254個代謝特征峰具有顯著性差異(p<0.05)，超聲破碎法有227個代謝特征峰的平均強度大于凍融循環破碎法，說明超聲破碎法能檢測到更多的代謝特征峰數目，并且對于共同檢測到的代謝特征峰具有更高的破碎效率。

圖1 2種細胞破碎方式的比較Fig.1 Comparison of two methods for cells disruptionA：results of feature number;B：Venn diagram comparison of feature numbers;C：box plot of RSD distribution

RSD常用于評價方法的重復性，在基于LC-MS的代謝組學研究中，單個代謝物最大的允許誤差為20%[17]。圖1A中，凍融循環破碎和超聲破碎方法得到的RSD≤20%的代謝特征峰數目分別為(446.00±3.03)和(467.83±4.79)。從RSD箱線圖(圖1C)可見，2種方法所檢測的代謝特征峰的RSD大部分小于20%，說明2種方法的重復性均良好。但超聲破碎法的均值和四分位距(IQR)范圍的RSD數值更小，表明超聲破碎法的重復性更好，且超聲破碎法耗時更短，操作更簡單，所以選擇超聲方法進行細胞破碎。

2.1.2 細胞提取溶劑的優化比較了80%甲醇(80%MeOH)、甲醇/異丙醇/水(M/IPA/W,2∶2∶1)、甲醇/乙腈/水(M/ACN/W,2∶2∶1)、甲醇/氯仿/水(M/CHCl3/W,2∶2∶1)和甲醇/甲基叔丁基醚/水(M/MTBE/W,2∶2∶1)5種溶劑體系的提取結果。實驗前，溶劑均于-20 ℃預冷，每種方法處理6個平行樣。如圖2A所示，5種溶劑提取得到的代謝特征峰數目分別為(628.67±11.50)、(518.83±7.83)、(503.50±8.41)、(526.00±4.60)和(539.83±12.12)，其中80%甲醇提取的代謝特征峰最多。5種提取溶劑檢測到203個相同的代謝特征峰，其中198個代謝特征峰具有顯著性差異(p<0.05)；比較相同代謝特征峰的平均強度，5種溶劑提取得到平均強度最大的代謝特征峰個數依次為66、4、7、120和1。這表明對于相同代謝特征峰，甲醇/氯仿/水的提取效果最好，其次為80%甲醇，其它3種提取效果較差。

此外，5種溶劑提取得到RSD≤20%的代謝特征峰數目分別為(511.50±10.33)、(422.00±3.83)、(439.83±7.47)、(375.00±5.71)和(380.50±10.52)，其中80%甲醇得到的代謝特征峰數目最多(圖2A)。從RSD箱線圖(圖2B)可見，5種提取溶劑的代謝特征峰的RSD大部分小于20%，表明5種提取溶劑的重復性很好，其中甲醇/乙腈/水的四分位距最小，表明RSD波動小，且四分位距范圍的RSD數值和均值最小，說明該提取溶劑的重復性最好。80%甲醇和甲醇/異丙醇/水在四分位距范圍的RSD數值分布和均值比前者略大，重復性次之，而甲醇/甲基叔丁基醚/水和甲醇/氯仿/水在四分位距范圍的RSD數值分布最寬，均值最大，表明重復性較差。綜上，80%甲醇的提取效果較好，且溶劑更安全，因此本實驗選擇80%甲醇為提取溶劑。

圖2 5種溶劑的提取結果Fig.2 Results of five solvents for metabolites extractionA：results of feature number;B：box plot of RSD distribution

2.1.3 提取溶劑體積的優化考察了80%甲醇的體積(500、800、1 000 μL)對細胞代謝物提取效果的影響，每種方法6個平行樣。結果顯示，上述3種溶劑體積提取的代謝特征峰數目分別為(609.33±11.68)、(722.83±10.41)和(677.67±11.02)，其中800 μL提取到的代謝特征峰最多(圖3A)；此外，3種體積檢測到504個相同的代謝特征峰(圖3B)，其中40個代謝特征峰具有顯著性差異(p<0.05)，3組數據中平均強度最大的代謝特征峰個數依次為6、12和22，說明體積對于相同代謝特征峰的強度影響不明顯。

此外，上述3種溶劑體積得到RSD≤20%的代謝特征峰數目依次為(467.33±9.71)、(610.00±8.54)和(528.00±8.89)，800 μL溶劑提取的代謝特征峰數目最多(圖3A)。RSD分布的箱線圖(圖3C)顯示，3種體積提取的代謝特征峰的RSD大部分小于20%，表明3種體積提取的重復性很好，但溶劑體積為800 μL時RSD的均值最小，且在四分位距范圍的RSD最小，表明800 μL提取的重復性更好，所以提取溶劑體積選擇800 μL。

圖3 3種溶劑體積的提取結果Fig.3 Results of three solvent volumesA：results of feature number;B：Venn diagram comparison of feature numbers;C：box plot of RSD distribution

2.2 方法學考察

按照 “1.6”方法考察了儀器穩定性、方法重復性和日內精密度。在儀器穩定性考察中，98%的代謝特征峰的RSD小于20%；在方法重復性考察中，93%的代謝特征峰的RSD小于20%；在日內精密度考察中，88%的代謝特征峰的RSD小于20%。以上結果表明，儀器穩定性和方法重復性較好，樣本在12 h內較穩定，可用于細胞代謝組差異分析。

2.3 細胞的代謝物分析

按照“1.3”對K562和K562-ADM細胞(每個樣本的細胞數量為2×106個)進行前處理，“1.4”條件進行分析，每隔5個樣本穿插1個QC樣本以監測實驗過程。將所得數據導入MetaboAnalyst 4.0進行PCA分析，利用OPLS-DA模型進行差異代謝物篩選。PCA分析結果見圖4A，可見QC樣本聚集緊密，表明建立的實驗方法穩定，可用于下一步的代謝分析。OPLS-DA模型的解釋能力和預測能力參數分別為R2Y=0.940和Q2=0.932(圖4B和4C)，說明該模型可靠。同時，OPLS-DA模型的置換檢驗結果的R2Y與Q2均小于未置換前所建立的模型，且Q2有負截距，表明所建立的模型無過擬合(圖4D)。從OPLS-DA得分圖可得，K562和K562-ADM的細胞代謝物存在明顯差別。圖4E為OPLS-DA模型中變量的S-曲線，篩選出VIP>1的變量，再以經校正的p值<0.05結合倍數變化(FC>2或FC<0.5)驗證2組數據間存在顯著性差異，篩選出40個差異特征峰，按照“1.5”方法進行定性分析，結果見表1。

圖4 K562和K562-ADM細胞的PCA和OPLS-DA結果Fig.4 PCA and OPLS-DA analysis results of K562 group and K562-ADM groupA：score plot for PCA;B：score plot for OPLS-DA;C：result for OPLS-DA model;D：permutation test result for OPLS-DA;E：S-plot

表1 K562和K562-ADM細胞間的差異代謝物Table 1 Summary of significant changed metabolites between K562 and K562-ADM group

(續表1)

K562和K562-ADM細胞間的差異代謝物的倍數變化如表1所示，與K562細胞相比，K562-ADM耐藥細胞中有17種代謝物的水平降低(FC>2)，其中L-肉堿和2-甲基鳥苷的水平顯著低于K562細胞中的含量；K562-ADM耐藥細胞中有23種代謝物的水平升高(FC<0.5)，其中腺嘌呤和鳥苷的水平顯著高于K562細胞。從代謝途徑分析，這些差異代謝物涉及氨基酸代謝、鞘脂代謝、嘌呤代謝以及嘧啶代謝等。其中，L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸和L-亮氨酸等氨基酸在K562-ADM細胞中的水平較高。氨基酸是構成蛋白質的基本單位，當氨基酸參與合成的ABC轉運蛋白在癌細胞中過表達，而使治療藥物外泵，這是癌細胞產生多藥耐藥性的重要機制之一[18]。同時，氨基酸也是嘌呤及嘧啶環生物合成的原料，K562-ADM耐藥細胞中，參與嘌呤代謝和嘧啶代謝的鳥苷、腺嘌呤和胸苷等物質的含量顯著增加，表明耐藥細胞可能在細胞增殖中對核苷酸的需求不同于敏感細胞，且嘌呤核苷酸對于細胞內能量的提供和信號傳導的作用非常重要。此外，環腺苷酸(cAMP)在K562-ADM耐藥細胞的含量降低，cAMP作為一種調控因子，可通過cAMP的蛋白激酶途徑調控細胞周期過程的增殖、分化和死亡。有實驗表明cAMP隨濃度的降低，對K562-ADM耐藥細胞增殖的抑制作用減弱，且白血病患者服用cAMP復方制劑可一定程度上改善治療效果，這證明了cAMP可能調控白血病的多藥耐藥性[19-21]。此外，α-半乳糖基神經酰胺、鞘氨醇、鞘磷脂(d18∶0/14∶1(OH))和膽堿等物質可能通過鞘脂代謝和甘油磷脂代謝參與細胞膜、線粒體膜等生物膜的構成與功能活動，這些物質以及其它具有差異性的物質在白血病耐藥機制方面尚需進一步研究。

3 結 論

本文以人慢性髓系白血病細胞及其阿霉素耐藥細胞(K562和K562-ADM)為研究對象，建立了基于UPLC-IT-TOF MS的非靶標代謝組學分析方法。考察了細胞破碎方式、提取溶劑體系和提取溶劑體積對白血病細胞代謝物的提取效果，發現以超聲進行細胞破碎，采用800 μL的80%甲醇為提取溶劑，方法簡單、可靠，提取到的代謝特征峰較多。采用建立的方法對K562和K562-ADM細胞代謝物進行分析，結果表明：相比K562細胞，K562-ADM耐藥細胞中有17種代謝物的含量顯著降低，23種代謝物的含量顯著增高。差異代謝物主要參與氨基酸代謝、鞘脂代謝、嘌呤代謝和嘧啶代謝等通路，參與代謝的L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸和L-亮氨酸等氨基酸和cAMP等物質與已知的白血病耐藥性機制相關。此外，其它差異代謝物與白血病耐藥性相關的分子機制需要進一步研究。