智能手機微孔板分析儀的開發與HSA的定量檢測

晁曉欣，李海琴，楊澤華，張校亮，譚 慷，李曉春*

(1.太原理工大學 新型傳感器與智能控制教育部與山西省重點實驗室 物理與光電工程學院，山西 太原 030024；2.太原理工大學 生物醫學工程學院，山西 太原 030024；3.山西醫科大學第六醫院，山西 太原 030008)

人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是由肝實質細胞合成的一種蛋白質，人體血液包含的蛋白質中HSA的含量最多，所占比例約為40%～60%。HSA對于確保血漿滲透壓維持在穩定值，調節體腔間液體分布具有重要作用，是臨床血常規檢測的重要指標之一，正常人體血液中HSA的濃度值為35～ 55 g/L，其濃度水平的增高或降低可以預示多種疾病[1-2]。目前HSA的檢測方法主要有鹽析法、電泳法和比色法[3]，相比其它檢測方法，比色法具有反應快速、操作簡便和檢測準確的優點。溴甲酚綠比色法通過建立反應溶液的色度信息與HSA濃度值的關系實現HSA的定量檢測，是臨床檢測HSA的常用方法。

智能手機具有普及范圍廣、輕量便攜、高分辨率成像和強大的數據處理功能等優點，且可以遠程傳輸實現數據的實時共享[4]，其內置有多種傳感器可以實現生化指標的即時檢測[5-6]。手機攝像頭是最常用的一種傳感器，可進行樣品的數字圖片采集并實現比色分析檢測。近幾年，研究人員開發了許多基于智能手機的檢測設備，并將其用于醫學指標[7-9]和其它生化分子檢測[10-11]。相比目前實驗室中使用的大型檢測儀器，利用智能手機開發的便攜式、低成本的檢測設備可以面向普通用戶，在現場快速檢測領域具有巨大潛力。微孔板是一種高通量反應容器，利用它可以提高檢測速度并降低檢測成本，有利于疾病的快速診斷并降低檢測費用。目前微孔板的分析主要依賴于酶標儀，而酶標儀是一種光譜分析儀器，內部包含精密的光學元件和復雜的光路設計，其體積大、價格昂貴、操作復雜且依賴于電腦，難以應用到現場快速檢測中。基于此，將智能手機和微孔板結合起來開發新的便攜式檢測儀器引起了研究人員的廣泛關注。但是實驗中存在一個問題，即手機攝像頭無法對尺寸很大的96微孔板全范圍準確成像，研究者提出了很多方法來解決這個問題。2015年，Berg等[12]提出使用96根光纖采集微孔板的圖像，再將獲得的圖像用手機攝像頭進行拍照和自動分析處理的方法。這種方法使用光纖對大尺寸的微孔板進行圖像采集，再將光纖采集的小尺寸圖像用手機進行拍照，解決了手機攝像頭不能對微孔板全范圍準確成像的問題。2016年，Wang等[13]設計制作了一個由64個小的微棱鏡構成的微棱鏡陣列，將微棱鏡陣列放置在微孔板上方使每一個微孔都正對一個微棱鏡，由于從微孔板中透射的光線會在微棱鏡中發生折射，并且微棱鏡的斜三角形設計會讓光線偏折進手機攝像頭中，從而實現了智能手機對微孔板中64個微孔的準確成像分析。2018年，Wang等[14]成功地將之前的微棱鏡擴展為96個微棱鏡，實現了96個微孔的準確成像分析。使用微棱鏡的方法改變了光路的方向，使微孔板中的光線偏折會聚到手機攝像頭中，實現了智能手機對微孔板全范圍準確成像。隨后，Yang等[15]嘗試利用反射鏡將微孔板底部的圖像反射到手機攝像頭中實現智能手機對96微孔板的全范圍準確成像，該方法將之前手機攝像頭從微孔板上方成像變為對微孔板底部成像，解決了手機對微孔板拍照時，液面反射光對實驗的影響，但該方法無法解決智能手機對微孔板全范圍準確成像的問題。綜上所述，使用光纖和微棱鏡的方法可以解決全范圍成像的問題，但是光纖采集圖像和微棱鏡的制作工藝都非常復雜且成本很高，無法廣泛應用于資源有限和不發達地區。2019年，李偉等[16]提出直接利用手機攝像頭對微孔板中的反應溶液進行拍照，利用計算機對獲得的圖像進行自動分析處理，然后再將檢測結果顯示在手機界面上的方法。文中開發的檢測系統在手機距離微孔板180 mm時才能對32個微孔進行準確成像，要實現手機攝像頭對尺寸很大的96微孔板全范圍準確成像，就必須增加手機到微孔板的距離，但這會增加檢測裝置的體積并且降低成像的分辨率，難以應用到現場快速檢測中。

為了更好地解決這個問題，本文采用大孔徑的聚焦透鏡對光線進行折射會聚，以實現智能手機對96微孔板的全范圍準確成像。通過設計面光源為微孔板提供均勻照明，以3D打印技術制作光學裝置，并結合智能手機應用程序開發了一款便攜式微孔板分析儀。采用開發的分析儀實現了病人血清樣品中HSA的快速定量檢測，且檢測結果與生化分析儀檢測結果一致，可以滿足臨床檢測的需求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TKA-Genpure UV 超純水系統(美國賽默飛世爾公司)；Starter 3100 pH計(美國奧豪斯公司)；MB100-4A微孔板恒溫振蕩器(杭州奧盛儀器有限公司)；Pipet-Lite XLS多通道移液槍(美國梅特勒托利多公司)；Multiskan FC酶標儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)。

溴甲酚綠(變色范圍3.8～5.4，Bio Basic Inc公司)；人血清白蛋白(HSA，96%～99%)、疊氮鈉(分析純，≥99.5%)購自索萊寶公司；氫氧化鈉(≥98.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；檸檬酸(≥99.5%，科密歐公司)；檸檬酸鈉(分析純，≥99%)、Tween-20購自美國Sigma-Aldrich公司；人血清白蛋白標準物質(國家標準物質中心)；人血清實際樣品來自山西醫科大學第六醫院；實際樣品濃度值由日立全自動生化分析儀7600P測得。

1.2 溴甲酚綠顯色劑的制備

檸檬酸緩沖液(pH 4.2)：將0.1 mol/L的檸檬酸和0.1 mol/L的檸檬酸鈉按照12.3∶7.7的體積比混合，配成pH 4.2的緩沖液。

溴甲酚綠顯色劑：向419 mg的溴甲酚綠中加入10 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液和100 mg的NaN3，用檸檬酸緩沖液定容至1 000 mL，隨后在每1 mL溶液中加入2.5 μL Tween-20，溶液由藍綠色變為黃綠色，即制得溴甲酚綠顯色劑。

1.3 白蛋白標準樣品的制備

人血清白蛋白標準物質溶液中白蛋白的質量濃度為42.9 g/L，取50 μL HSA標準物質加入2.6 mg白蛋白粉末配成85.8 g/L的白蛋白溶液。用檸檬酸緩沖液稀釋白蛋白溶液，制備成質量濃度分別為60.06、55.77、51.48、47.19、42.90、38.61、34.32、30.03、25.74、21.45 g/L的10個白蛋白標準樣品。

1.4 智能手機微孔板分析儀的開發

1.4.1 智能手機的光學裝置為了給微孔板提供均勻的照明并避免周圍環境光的影響，設計了一個可以與智能手機結合使用的光學裝置。該光學裝置的示意圖如圖1A所示，整個裝置尺寸為144 mm×144 mm×135 mm。圖1B為光學裝置的內部結構，主要由面光源、微孔板插槽、透鏡和智能手機拍照口組成，裝置各部分固定封閉在外殼里，透鏡固定在微孔板的正上方，外殼上面有一個拍照孔，手機通過拍照孔對微孔板進行拍照成像。整個裝置采用3D MAX Studio設計，并使用3D打印機(惠普)打印。面光源放置在微孔板的下方，光從微孔板透射出來后進入透鏡中，經透鏡的折射會聚到手機攝像頭中。實驗中使用220 V交流電為面光源供電，使用華為Honor7i智能手機進行拍照和數據分析。圖1C所示為智能手機應用程序測定HSA的實際過程以及待放入的微孔板。

圖1 基于智能手機微孔板分析儀的光學裝置示意圖(A)、內部結構圖(B)以及智能手機測定HSA實際操作過程(C)Fig.1 Schematic diagram(A),internal structure(B) of optical device on smartphone-based microplate reader and the operation for measuring HSA concentration using a smartphone(C)

1.4.2 智能手機應用程序檢測原理及過程本文設計的智能手機應用程序在華為Honor7i手機上進行調試，此程序也可以安裝在其它Android操作系統的手機上。圖2為應用程序“HSA Detect”運行界面。用戶點擊手機桌面上的應用程序圖標后，程序開始運行并進入主界面(圖2A)，主界面有3個選項：“Detect”、“Help”和“Quit”。當用戶點擊界面上的“Detect”按鈕后，程序進入檢測界面(圖2B)，屏幕上顯示96微孔板矩形預覽框，使每個矩形預覽框與微孔板的微孔對齊，自動聚焦后點擊拍照圖標按鈕，此時應用程序自動調用智能手機的相機拍攝照片，同時在后臺自動處理圖片和分析數據。最后，用戶點擊“Analyze”按鈕，樣品的色度信息以及檢測結果將顯示在結果界面(圖2C)。應用程序分析處理的過程首先是將獲得的圖片裁剪，計算各微孔中心區域25×25 pixel像素區域的平均像素強度并將其轉換為RGB值，然后根據標準樣品的RGB值和濃度值之間的關系自動擬合標準曲線，最后將待測樣品的RGB值代入標準曲線得到對應的濃度值，并將檢測結果顯示在智能手機屏幕上。

圖2 智能手機檢測HSA的手機界面Fig.2 Smartphone app interface of HSA detectionA.main menu; B.detection interface; C.results interface

2 結果與討論

2.1 智能手機微孔板分析儀成像效果分析

智能手機攝像頭對96微孔板進行成像時，正對手機攝像頭的微孔可以準確成像，而邊緣的微孔由于手機攝像頭視場有限，導致部分孔底光線無法進入攝像頭中，從而無法對其準確成像。智能手機微孔板分析儀中手機攝像頭的位置是固定的，但是每個微孔到手機攝像頭的角度和位置都不同，因此，手機攝像頭對96個微孔所成的像均不一樣，導致96個微孔的背景顏色不一致，無法實現待測樣品的準確比色分析。為解決該問題，采用對光線具有折射會聚作用的透鏡，使從微孔板中透射出來的光線經過透鏡折射后會聚到手機攝像頭中，實現對96微孔板中所有微孔的準確成像。

為了對使用透鏡前后智能手機的成像效果進行分析，在微孔板的所有微孔中加入濃度、體積均相同的品紅色墨水，然后用智能手機進行拍照。圖3A是手機直接對微孔板拍照獲得的圖片，從圖中可以看出邊緣微孔的孔底無法準確成像，拍照時會拍到孔底邊緣，在對獲得的圖片進行顏色分析時，孔底邊緣會對樣品的色度信息產生影響，從而影響樣品檢測的準確性。圖3B是使用透鏡后智能手機對微孔板拍照獲得的圖片，從圖中可以看出所有微孔均可準確成像，且所成的像和手機攝像頭正對微孔拍照時的成像一致，可以看到完整的孔底。使用透鏡后智能手機攝像頭獲得的微孔板圖片中，微孔的背景顏色是孔底的顏色，且所有樣品孔的背景顏色一致，可以滿足數字圖片比色分析的要求。

圖3 智能手機直接對微孔板拍照所獲得的圖像(A)以及放置透鏡后獲得的圖像(B)Fig.3 The image of a microplate directly captured by the smartphone(A) and the captured image of a microplate with a lens(B)

2.2 Tween-20含量的優化

Tween-20是一種常用的去離子表面活性劑，參與溴甲酚綠顯色反應時可使反應溶液由暗綠色變成桔黃色，降低其在630 nm處的空白吸光度值。為了降低實驗中反應溶液的空白背景，提高檢測的靈敏度和檢測范圍，需要確定Tween-20的最佳濃度。實驗中，用紫外可見分光光度計測定Tween-20含量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL/mL的溴甲酚綠溶液的吸光度值。結果如圖4所示，從圖中可以看出，隨著Tween-20含量的增加，溶液630 nm處的吸光度值逐漸下降，當Tween-20含量為2.5 μL/mL時，630 nm處的吸光度達到飽和，并且溶液的顏色由藍綠色變成桔黃色。為了保證溴甲酚綠顯色劑的空白吸光度值最小，且Tween-20試劑不過量，確定實驗中Tween-20的最佳含量為2.5 μL/mL。

圖4 溴甲酚綠溶液630 nm處的吸光度和Tween-20含量的關系Fig.4 Relationship between the absorbance at 630 nm of bromocresol green solution and Tween-20 content

2.3 顏色通道的選擇

智能手機數字圖片比色分析通過分析R、G、B值與濃度值之間的關系實現濃度測定，在不同實驗中，R、G、B 3個顏色通道對待測樣品的響應變化不同，因此，選擇合適的顏色通道對保證檢測結果的準確性具有重要意義。為了確定本儀器測定HSA溶液的最佳顏色通道，用開發的分析儀對HSA標準樣品進行拍照分析。在HSA檢測實驗中，隨著HSA濃度增加,溶液的顏色由黃綠色變為藍綠色，測定10個不同質量濃度的人血清白蛋白標準樣品，并將顯色完成后的溶液用智能手機拍照，計算所獲圖片中檢測區域的R、G、B值，并分析顏色值與質量濃度之間的關系。如圖5所示，R值和G值隨著HSA質量濃度的增加均表現出很寬的變化范圍，并且與質量濃度之間呈線性關系，相關系數分別是0.982 2和0.993 0，而B值沒有明顯的線性變化。此外，G值的線性相關度相比R值的更高，表明在HSA實驗中G值更敏感。因此，用開發的分析儀測定HSA濃度時，顏色通道選擇G通道。

圖5 RGB值隨HSA質量濃度的變化Fig.5 Variation of RGB value with HSA mass concentrationA.R value;B.G value; C.B value

2.4 基于智能手機微孔板分析儀檢測HSA

為了探究智能手機微孔板分析儀的準確性和可靠性，用開發的分析儀和商用酶標儀同時測定相同的樣品，并進行對比。配制不同質量濃度(21.45 ～60.06 g/L)的HSA標準樣品，將智能手機測得的反應溶液G值與酶標儀測得的吸光度進行比較。如圖6A所示，從圖中可以看出，兩種儀器的測定結果之間呈現良好的線性相關性，相關系數為0.989 3，證明開發的分析儀可以準確檢測樣品中HSA濃度。此外，正常人體中白蛋白的質量濃度范圍為35 ～55 g/L，因此實驗中確立的標準曲線可以滿足實際檢測的需求。

圖6 酶標儀和智能手機檢測結果的相關性(A)以及實際樣品中生化分析儀檢測結果和智能手機檢測結果的比較(B)Fig.6 Correlation of the measurement result between microplate reader and smartphone(A) and comparison of smartphone and the clinical analyzer in the detection of human serum samples(B)

為了進一步驗證所開發智能手機微孔板分析儀的實用性，采用開發的儀器測定12個病人血清樣品中的HSA濃度值，并將檢測結果與醫院全自動生化分析儀測定的結果進行比較。全自動生化分析儀的測定方法和本文方法均為溴甲酚綠法，兩種儀器的測定結果如圖6B所示，從圖中可以看出兩者的檢測結果呈現良好的一致性，從而驗證了本文設計開發的分析儀可以滿足臨床檢測的需求，同時，相比目前使用的全自動生化分析儀，所開發的檢測儀具有體積小、成本低廉和操作簡單的優點。

3 結 論

研究開發了基于智能手機的便攜式96微孔板檢測技術與儀器，并利用開發的儀器實現了HSA的高通量快速定量檢測。首次采用大孔徑聚焦透鏡實現了手機對微孔板的全范圍準確成像，設計了面光源為微孔板提供均勻照明，通過3D打印制作了光學裝置，結合開發的應用程序實現了對96微孔板中所有樣品的自動分析。利用該檢測儀器對HSA標準樣品進行測定，檢測結果與酶標儀檢測結果具有高度的線性關系，證明開發的分析儀具有良好的準確性和可靠性。用該儀器實現了病人血清樣品中HSA的定量檢測，檢測結果和醫院的全自動生化分析儀測定結果具有良好的一致性，可以滿足臨床中HSA的檢測需求。該分析儀具有體積小和成本低的優點，可廣泛應用于經濟不發達地區、基層醫療機構和普通用戶家中，實現HSA的現場快速定量檢測。