小麥葉銹菌效應蛋白Pt18906激發TcLr27+31的雙層防御反應

齊悅，呂峻元，張悅，韋杰，張娜，楊文香，劉大群

（1河北農業大學植物保護學院小麥葉銹病研究中心/河北省農作物病蟲害生物防治技術創新中心/國家北方山區農業工程技術研究中心，河北保定071001；2中國農業科學院研究生院，北京 100081）

0 引言

【研究意義】由小麥葉銹菌（Puccinia triticina）引起的小麥葉銹病嚴重影響小麥生產[1]，該病害在世界范圍分布廣泛[2]，嚴重發生時可造成15%—45%甚至更高的經濟產量損失[3]。小麥葉銹菌致病性多樣化且致病類型頻繁發生變異，導致小麥抗葉銹性不斷喪失。因此，研究小麥葉銹菌致病的分子機制對控制小麥葉銹病尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】植物的免疫機制主要由兩層防御體系構成[4]。第一層次防御系統是由植物細胞膜表面的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別病原微生物保守的模式分子（microbial- or pathogen-associated molecular patterns，MAMPs or PAMPs）引發的抗病反應，稱之為PTI（PAMPs-triggered immunity）[5]。第二層的防御系統是由植物細胞內的抗病蛋白（disease resistance protein，R protein），主要是NB-LRR類型的抗病蛋白直接或間接地識別病原微生物分泌到植物細胞內的效應因子，引發更為強烈的免疫反應，稱之為ETI（effector-triggered immunity）[6]。植物的PTI又稱為基礎抗性，是植物通過細胞膜表面的受體激酶（receptor-like kinases，RLKs）或受體蛋白（receptorlike proteins，RLPs）感受病原微生物的PAMPs從而觸發植物細胞的一系列反應[7]，比如細胞膜離子通道的激活，鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CPKs）的激活，細胞質內鈣離子濃度的變化，胼胝質的積累，MAPK級聯反應的激活，病程相關基因PRs的上調表達等。植物的ETI由病原菌分泌到寄主細胞中的一些被稱為“效應蛋白”的蛋白觸發[8]，效應蛋白能夠通過多種方式抑制植物免疫反應，包括抑制PTI[9]，促使病原成功侵染植物[10-13]。ETI往往在受侵染的植物細胞部位產生大量的過氧化物（如H2O2），并且誘導植物的過敏性壞死反應（hypersensitive response，HR）[14]。銹菌是專性寄生真菌，主要通過吸器從寄主細胞內吸收營養，進而有效的在寄主中擴展，產生孢子[15]。病原菌侵染時向寄主細胞分泌效應蛋白[16]，通過效應蛋白調控寄主的免疫防御反應，造成植物感病。銹菌效應蛋白在寄主中的作用機理尚不清楚，基因組、轉錄基因組測序成為探明銹菌效應蛋白功能的重要研究途徑。至今已完成多種植物病原銹菌的基因組測序和轉錄組測序，包括楊樹銹菌（Melampsora larici-populina）[17]、亞麻銹菌（Melampsora lini）[18]、小麥稈銹菌（Puccina graminisf.sp.tritici，Pgt）[19]、小麥條銹菌（Puccinia striiformisf.sp.tritici，Pst）[19-21]和小麥葉銹菌[22]。通過基因組測序，從楊樹銹菌的1 898個分泌蛋白中鑒定出1 184個CSEP（candidate effectors protein）[23]；從亞麻銹菌的1 085個分泌蛋白中鑒定出了762個CSEP[24]；在小麥稈銹菌的1 934個分泌蛋白中篩選出1 106個CSEP[19]；在條銹菌CY-32中篩選出2 029個CSEP[25]；在葉銹菌中預測到1 358個效應蛋白[26]。然而，銹菌中已經克隆出的效應蛋白數量非常有限，這些效應蛋白分別來源于亞麻銹菌的AvrM[27]、AvrL567[28]、AvrP123[29]、AvrP4[30]、AvrL2[31]和AvrM14[31]；蠶豆單胞銹菌（Uromyces fabae）的RTP1[32]，小麥稈銹菌的PGTAUSPE-10-1[33]、AvrSr35[34]、AvrSr50[35]和小麥條銹菌的Pst8853[36]、Pst23616[37]、Pstha5a23[38]、Pst87[39]、Pec6[40]、HASP2[41]、Pst30[42]、Hasp58[43]、PstGSRE1[44]、Pst8713、Pst12806[45]和Pst18363[46]。而對小麥葉銹菌效應蛋白的研究仍處于起始階段。BRUCE等[22]利用6個小麥葉銹菌菌株與小麥互作中的吸器形成階段開展轉錄組分析，獲得了222 571個銹菌中的序列，共篩選出532個候選效應蛋白；SEGOVIA等[47]在2016年發現Pt3和Pt27可分別在含有抗性基因Lr9或Lr24，Lr26的近等基因系中抑制GUS的表達；2017年，澳大利亞獲得了小麥葉銹菌中與抗病基因Lr20對應的候選效應蛋白，但并未開展相關功能的進一步分析。CUOMO等[26]在2017年對小麥稈銹菌、小麥條銹菌和小麥葉銹菌的基因組進行了測序結果比較，發現小麥葉銹菌基因組在這3個基因組中最大（估計為135 Mb），且基因組高度雜合，通過全基因組和RNA-seq在小麥葉銹菌的5個發育階段中總計預測到1 358個效應子，但是尚無相關功能驗證的報道?！颈狙芯壳腥朦c】中國小麥葉銹菌受種植小麥品種及地理環境的影響，具有與其他國家菌株不同的致病力，自2012年開始河北農業大學小麥葉銹病研究中心開展了小麥葉銹菌的效應蛋白的預測和相關分析，利用小麥葉銹菌與寄主互作的轉錄組篩選得到635個候選效應蛋白。其中Pt18906在小麥葉銹菌吸器形成階段顯著高表達，關于該基因的特性及其在致病中的作用尚不明確?！緮M解決的關鍵問題】對小麥葉銹菌效應蛋白Pt18906的基本特性進行分析，測試其在小麥抗葉銹近等基因系中對寄主胼胝質和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的影響，明確被誘導發生防御反應的近等基因系，揭示Pt18906在小麥近等基因系中對應的基因，探測該效應蛋白與對應抗葉銹基因的關系，為深入揭示Pt18906在致病中的作用及其調控機理打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2019年在河北農業大學植物保護學院完成。

1.1 供試植物

供試煙草為本氏煙（Nicotiana benthamiana）。39個以Thatcher為遺傳背景的小麥抗葉銹病近等基因系包括TcLr1、TcLr2a、TcLr2c、TcLr3、TcLr3Ka、TcLr9、TcLr10、TcLr11、TcLr14a、TcLr16、TcLr17、TcLr18、TcLrB、TcLr24、TcLr26、TcLr30、TcLr2b、TcLr14b、TcLr15、TcLr19、TcLr20、TcLr21、TcLr23、TcLr25、TcLr27+31、TcLr28、TcLr29、TcLr32、TcLr33、TcLr33+34、TcLr36、TcLr38、TcLr41、TcLr42、TcLr44、TcLr45、TcLr50、TcLr51和TcLr53，由CIMMTY惠贈，筆者實驗室保存。

1.2 供試菌株及培養條件

大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α購自天根（TIANGEN）公司，使用LB培養基在37℃條件下培養；農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101由中國農業大學孫文獻教授惠贈，在28℃條件下培養；酵母突變株為YTK12；熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株EtHAn 由西北農林科技大學康振生院士惠贈。

1.3 供試載體

煙草瞬時過表達載體PVX病毒載體pGR107由中國農業大學孫文獻教授惠贈，信號肽分泌功能驗證載體pSUC2和細菌三型分泌系統載體pEDV6由西北農林科技大學康振生院士惠贈。

1.4 Pt18906的克隆和載體構建

以小麥葉銹菌菌株13-5-72（THSN）侵染小麥葉片的RNA反轉錄產物為模板，克隆效應蛋白基因，分別利用引物（表1）構建到pGR107、pSUC2和pEDV6載體上，構建完成的載體用于煙草瞬時表達、信號肽分泌功能驗證、亞細胞定位和利用細菌三型系統開展的免疫反應測定。

表1 本試驗所用引物Table 1 The primers used in this study

1.5 農桿菌介導的煙草瞬時轉化

將構建的ΔSPPT18906-pGR107轉入農桿菌感受態細胞GV3101中，倒置培養2 d后挑取陽性克隆接種到含有100 μg·mL-1Kan和100 μg·mL-1Rif的5 mL LB培養基中。28℃，200 r/min 搖床中振蕩培養2—3 d至菌液渾濁后，用5 mL農桿菌緩沖液（100 mL滅菌水+1 mL MgCl2（10 mmol·L-1）+1 mL 2-（N-嗎啉）乙磺酸（10 mmol·L-1））洗滌3次，稀釋至OD600=0.3，Bax和INF1稀釋至OD600=0.3避光靜置2 h；選擇6—8周齡本氏煙草植物葉的第2—4葉接種，并使用1 mL的無針注射器滲透入葉中。在注射之前將效應蛋白基因構建體和Bax或INF1構建體以1﹕1比例混合，同時注射，設定為0 h抑制試驗；將含有效應蛋白的農桿菌菌株在造成細胞死亡的Bax或INF1構建體前24 h注射煙草，定為24 h抑制試驗。在煙草葉上測試效應蛋白，并將該試驗重復3次，在5—7 d內觀察細胞死亡情況，接種后7 d對葉片進行拍照。

1.6 Pt18906信號肽分泌功能的驗證

采用酵母信號肽篩選（yeast signal peptide screen，YSST）驗證效應蛋白信號肽的分泌功能。試驗中選用的酵母菌株為缺失蔗糖轉化酶基因、在以蔗糖為唯一碳源的培養基上不能生長的YTK12。選用的載體質粒為含有色氨酸合成基因和一個缺失信號肽與起始密碼子ATG的蔗糖轉化酶基因（SUC2）的pSUC2。

1.6.1 酵母感受態的制備與轉化 在YPDA固體培養基上28℃活化酵母菌株YTK12；2—3 d后刮取適量的酵母菌，配置反應體系（10XLiAc 36 μL，50%PEG3500 240 μL，鮭魚精ssDNA（2 ng·mL-1）50 μL，酵母感受態細胞50 μL，pSUC2-效應基因的重組載體5 μL，ddH2O 80 μL），混勻，放置42℃ 50 min；9 000 r/min離心1 min，棄上清；加入150 μL水，吹吸混勻，涂布于SD-Trp的培養基平板上，28℃培養2—3 d。

1.6.2 信號肽分泌功能的檢測 將SD-Trp培養基上生長的陽性克隆轉接到YPRAA培養基上，28℃倒置培養，如果能在YPRAA培養基上繼續生長，則證明候選信號肽序列具有分泌功能；若不能生長則證明候選信號肽序列無分泌功能。

1.7 Pt18906的實時熒光定量分析

將小麥葉銹菌菌株13-5-72（THSN）接種在小麥Thatcher完全展開的第一葉上，黑暗條件下保濕（保濕溫度16℃，相對濕度100%），接種后分別采取0、6、12、18、24、36、48、72、96 h和6、9、12 d的樣品，將上述12個時間點的樣品按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提供的方法提取總RNA，反轉錄成cDNA。使用熒光定量PCR儀（羅氏LightCycler480），以各取樣點侵染的葉片cDNA為模板，以葉銹菌夏孢子的肌動蛋白β-Actin為內參基因，進行PCR擴增引物為RTPt18906-F：ATACGATGGTCTGGGTT；RTPt18906-R：TTGTTTT GTCTGGTGGA，每個反應生物學重復3次。PCR反應結果按照2-ΔΔCT法計算目的基因在不同時間點的相對表達量。

1.8 Pt18906抑制Bax誘導的細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）功能motif分析

為進一步確定在候選效應基因中負責抑制PCD過程的功能結構域，采用氨基酸逐步缺失的方法，將缺失部分氨基酸的候選效應基因的序列構建到PVX載體上，利用農桿菌侵染煙草細胞試驗來驗證突變的候選效應基因對Bax誘導的PCD功能，從而鑒定其功能結構域。

1.9 Pt18906亞細胞定位

將ΔSP Pt18906-pGR107重組載體電轉入農桿菌感受態細胞GV3101中，倒置培養2 d后挑取陽性克隆接種到含有相應抗性的5 mL LB培養基中。28℃，200 r/min搖床中振蕩培養至菌液渾濁后，用5 mL農桿菌緩沖液洗滌3次；稀釋至OD600=0.2，避光靜置2 h；選擇8葉左右的本氏煙草植物葉的第2—4葉接種，并使用無針注射器滲透入葉中，以GFP為對照。農桿菌注射后2 d，剪取注射的煙草葉片，利用熒光顯微鏡觀察效應蛋白的表達量以及定位；之后撕取煙草葉片下表皮在0.8 mol·L-1的山梨醇中浸泡15 min，熒光顯微鏡下觀察。

1.10 Pt18906的無毒性功能分析

將重組質粒ORFPt18906-pGR107利用農桿菌轉化法轉到農桿菌GV3101中。Pt18906構建體稀釋至OD600=1.0，靜置于28℃ 3 h，后用于注射全套的近等基因系。觀察效應蛋白在不含抗病基因和含有不同抗病基因的小麥中過表達能否激發過敏性細胞壞死反應（HR）。選取感病材料Thatcher作為對照，在39個小麥抗葉銹病近等基因系中瞬時表達效應蛋白Pt18906，注射5 d后觀察表型，7 d拍照，并取樣利用DAB進行染色，觀察過氧化氫（H2O2）積累情況。

1.11 細菌三型分泌系統介導的小麥瞬時轉化

將質粒轉化進入熒光假單胞感受態EtHAn中。挑取菌落接種到含50 μg·mL-1慶大霉素和30 μg·mL-1氯霉素抗性的培養基中，菌液渾濁后，用10 mmol·L-1MgCl2溶液洗滌3次，將處理好的菌液稀釋至OD600=1.0，28℃避光放置2 h，用于注射小麥葉片。

Pt18906誘導的胼胝質的觀察：采集含有Pt18906載體熒光假單胞菌株EtHAn注射后12、24、36、48和72 h的小麥葉片，將葉片浸泡在脫色液（乙醇和冰醋酸（1﹕1）混合）中，完全脫色后轉入水合氯醛中處理過夜；加入0.05%苯胺藍染液染色，在熒光顯微鏡下觀察胼胝質的積累情況并隨機選取50個視野，統計胼胝質的數目。

Pt18906誘導的活性氧的觀察：采集EtHAn注射后0、5、10、15、20和30 min的小麥葉片，用1%硝基藍四氮唑染液染色超氧陰離子，強光下光照4—8 h；使用無水乙醇染色完畢后脫色，在水合氯醛溶液中過夜處理。利用ASSESS軟件統計每個葉片的染色面積占總注射葉片面積的百分比，每個樣品生物學重復3次。

2 結果

2.1 Pt18906的序列及結構分析

通過克隆獲得一個開放閱讀框長為672 bp的Pt18906，編碼223個氨基酸，具有8個半胱氨酸殘基，與小麥葉銹菌BBBD的PTTG_11719同源性達到99%。利用SignalP 4.1在線軟件預測，發現該效應蛋白的1—27 aa 為信號肽區域（圖1-A）。使用Target P預測編碼的蛋白，發現該蛋白不含有線粒體定位信號序列，利用TMHMM 2.0在線軟件預測無跨膜結構；利用Pfam在線軟件分析該效應蛋白無保守基序；利用MEME在線軟件分析目的基因編碼的蛋白無保守結構域；Pt18906編碼的蛋白等電點（pI）為7.535，證明此效應蛋白的工作環境偏向于堿性；利用在線軟件Swiss-Model預測得出效應蛋白的三級結構（圖1-B），Pt18906的二級結構含有12.56%的α-螺旋，并且存在13%的延伸鏈、4.48%的轉角和69.96%的無規則卷曲。

圖1 Pt18906的序列分析Fig.1 Sequence analysis of Pt18906

2.2 效應蛋白Pt18906抑制Bax和INF1誘導的細胞程序性死亡

為了測試效應蛋白是否能抑制PCD，Bax和INF1在候選效應基因注射后24 h注射到4—6周齡的本氏煙草植物中，注射排布如圖2-A。從表型可以看到單獨注射載體GFP的位點沒有出現PCD現象，證明載體對PCD的產生沒有任何影響。注射GFP和Bax/INF1的位點出現壞死，單獨注射Bax/INF1的位點在5 d左右出現了壞死，而單獨注射Pt18906的位點沒有出現壞死，但在注射Pt18906后24 h注射Bax/INF1的位點沒有出現壞死，說明該基因抑制了Bax/INF1引起的PCD（圖2 B-1/B-3）。為了排除先注射基因可能會占據Bax/INF1誘導PCD的作用位點，將Bax、INF1和效應蛋白按照1﹕1（V/V）混合后注射到煙草葉片中，從表型結果，看到Pt18906依然能夠有效抑制住Bax/INF1激發的PCD（圖2B-2/B-4）。

圖2 Pt18906抑制Bax和INF1誘導的細胞程序性死亡Fig.2 Pt18906 inhibits PCD induced by Bax and INF1

2.3 Pt18906信號肽分泌功能驗證

為檢測重組質粒的分泌功能，挑取在SD-Trp培養基上生長的陽性克隆，轉接到YPRAA培養基上，檢測轉化酵母細胞是否能夠在YPRAA培養基上能生長。選用大豆疫霉（Phytophthora sojae）中的分泌型效應蛋白Avr1b的信號肽為陽性對照，選用稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的非分泌性蛋白Mg87為陰性對照。結果發現，含有Avr1b與缺失SUC2的轉化子在篩選培養基中能夠正常生長，含有Pt18906效應蛋白信號肽及缺失SUC2重組載體的酵母菌株在SD-Trp培養基中能正常生長，分泌型效應蛋白Avr1b能在YPRAA培養基中正常生長，但Pt18906效應蛋白信號肽不能在YPRAA培養基中正常生長，說明效應蛋白的信號肽沒有分泌功能，從而確認Pt18906效應蛋白為非分泌型蛋白（圖3）。

2.4 Pt18906表達量分析

通過對Pt18906在小麥葉銹菌不同生長發育階段以及小麥葉片侵染過程的表達趨勢進行分析，結果表明候選效應蛋白在0—24 h階段逐漸上調表達，在24 h達到表達高峰，之后表達量呈現出逐漸下調的趨勢（圖4）。

圖3 Pt18906信號肽分泌功能驗證Fig.3 Verification of signal peptide secretory function of Pt18906

圖4 Pt18906在小麥葉銹菌13-5-72和Thatcher互作中不同時間點的表達量Fig.4 Pt18906 expression at different time points in P.triticina 13-5-72 and Thatcher interaction

2.5 效應蛋白Pt18906毒性功能

為探知Pt18906決定相關功能的結構域，構建了6個缺失突變體，包括N-末端缺失20個氨基酸的突變體和C-末端缺失突變體，分別缺失30個（Δ194—224）、60個（Δ164—224）、90個（Δ134—224）和120個（Δ104—224）氨基酸。缺失突變體農桿菌注射煙草的結果發現，從C-末端缺失30、60、90和120個氨基酸的突變體均能抑制細胞壞死，而N-末端缺失20個氨基酸的突變體喪失了抑制細胞壞死的能力（圖5）。表明Pt18906效應蛋白28—47位的氨基酸序列對其毒性功能具有重要作用。

2.6 效應蛋白Pt18906的作用位點

利用GFP對Pt18906進行亞細胞定位分析，質壁分離后發現pGR107-GFP載體（對照）在細胞核及細胞質中均有表達，綠色熒光分布在整個細胞內，Pt18906與GFP融合蛋白表達激發的綠色熒光同樣充斥整個細胞內（圖6），證明效應蛋白Pt18906在細胞內起作用。

2.7 Pt18906的無毒效應

利用農桿菌侵染的方法檢測Pt18906在39個小麥抗葉銹病近等基因系中過表達效應蛋白，注射5 d后觀察過敏性壞死反應發生的情況。結果發現攜帶有空載體pGR107的農桿菌株注射沒有引起壞死，Pt18906在近等基因系TcLr27+31和TcLr42上出現了壞死反應，用DAB對小麥葉片進行染色，發現出現壞死反應的部位被DAB染成棕褐色（圖7），在顯微鏡下觀察到棕褐色，說明有H2O2的存在，表明效應蛋白觸發了寄主的防御反應，小麥TcLr27+31和TcLr42中存在與效應蛋白互作的分子靶標。

2.8 Pt18906在寄主上誘導的胼胝質分析

采用細菌的三型分泌系統將效應蛋白遞送到小麥中，以MgCl2、EtHAn和轉化有pEDV6的熒光假單胞菌作為對照。注射后的0、12、24、36、48、72 h采集組織學樣品，與對照相比，Pt18906在小麥中激發了胼胝質的產生，從12 h及可以觀察到胼胝質的產生，而且隨著時間的延長，胼胝質的積累逐漸增強（圖8），表明效應蛋白Pt18906能夠促進TcLr27+31胼胝質的積累，觸發了寄主的防御反應。

圖6 Pt18906亞細胞定位Fig.6 Subcellular localization of Pt18906 in N.benthamiana

圖7 在小麥中過表達Pt18906激發壞死反應Fig.7 Overexpression of Pt18906 in wheat stimulates HR

圖8 在TcLr27+31中瞬時表達Pt18906引起胼胝質的積累Fig.8 Expression of Pt18906 in TcLr27+31 causes accumulation of callose

2.9 Pt18906在寄主上誘導的活性氧分析

利用植物組織O2-能被捕獲劑NBT進行原位捕獲和顯色，藍色的位置代表存在O2-。統計結果顯示，與對照MgCl2、EtHan和pEDV6相比，Pt18906激發的活性氧面積更大（圖9），并且在效應蛋白注射后活性氧先升高，在注射10 min達到最高，之后降低，表明效應蛋白Pt18906能夠引起TcLr27+31活性氧的迸發，觸發了寄主的防御反應。

圖9 在TcLr27+31中瞬時表達Pt18906引起活性氧的迸發Fig.9 Expression of Pt18906 in TcLr27+31 causes ROS bursts

3 討論

銹菌作為活體營養寄生真菌可通過形成吸器侵入寄主細胞，參與寄主與病原物之間營養物質和信息的交換與傳遞。國內外學者已在不同銹菌中鑒定出了多種效應蛋白，這些已鑒定的效應蛋白均為編碼未知功能的分泌蛋白，多無明顯功能結構域及明確的生化功能。本研究對小麥葉銹菌Pt18906進行序列和結構分析，初步確定其為候選效應蛋白，其可抑制Bax和INF1誘導的細胞壞死。目前對于病原菌效應蛋白序列特征的定義都是基于已經發現的效應蛋白的一些特征來總結的，但是由于病原菌效應蛋白本身的多樣性與不保守性，如果根據這些特征來進行效應蛋白的篩選會存在一定的局限性。大麥白粉病菌（Blumeria graminisf.sp.hordei，Bgh）中的無毒基因Avra10和Avrk1[48]編碼的均為非分泌型蛋白，如果根據大部分效應蛋白為分泌蛋白的特征來定義效應蛋白，會丟失一些非分泌型的效應蛋白。本研究中效應蛋白Pt18906信號肽無分泌功能，為少數的非分泌型效應蛋白，在胞內起作用。對于非分泌型效應蛋白是如何運輸到胞內起作用的，有待于進一步研究。另外該效應蛋白的三級結構含有較高的無規則卷曲（69.96%），推測其可能為具有識別功能的、對其他蛋白質特異的功能性蛋白。Pt18906在24 h表達量最高，此時間點為葉銹菌形成吸器母細胞的關鍵點，也是寄主有效抵抗病原物的一個關鍵點，因此推測Pt18906可能在葉銹菌與寄主植物侵入過程中被寄主識別。

關于效應蛋白發揮功能的結構域，不同的效應蛋白存在差異，但多在N端起作用。在對小麥條銹菌的研究中發現，通過氨基酸缺失的方法檢測效應蛋白的毒性區域，其中小麥條銹菌Pst82、Pst148、Pst227、Pst8853和Pst9302成熟蛋白N末端10—20位、23位、20—40位、20—30位和20—40位的氨基酸序列分別對其毒性功能具有重要作用[36]。本研究中，同樣通過氨基酸逐步確實法對效應蛋白Pt18906進行功能區域驗證，發現在N末端缺失28—47位的20個氨基酸的突變體無抑制壞死功能，表明28—47位的AEVQRHAFSRRGKENDKPPP氨基酸序列對Pt18906發揮功能具有重要作用。

植物的免疫機制主要由PTI和ETI兩層防御體系構成。季森等[41]利用細菌三型分泌系統將HASP2在小麥中過表達，發現其可以抑制寄主PTI相關胼胝質的積累，同時對HASP2過表達的小麥接種無毒性菌系CYR23后，發現HASP2可以抑制寄主ETI相關活性氧積累和減少細胞壞死面積，推測小麥條銹菌效應蛋白HASP2抑制寄主的免疫反應；王力坤等[42]研究表明，小麥條銹菌效應子Pst30抑制植物的胼胝質和活性氧積累，推測Pst30可抑制寄主植物的PTI和ETI，從而促進自身的侵染；陳增菊等[43]研究發現，小麥條銹菌效應蛋白Hasp58抑制熒光假單胞菌引起的胼胝質積累和活性氧的迸發，推測Hasp58同樣可以抑制寄主植物的PTI和ETI，并促進自身的侵染。本試驗通過細菌三型分泌系統在TcLr27+31上表達效應蛋白Pt18906，發現Pt18906激發了TcLr27+31胼胝質的積累，且該效應蛋白同樣可造成活性氧的積累，進而造成O2-的迸發，說明Pt18906觸發了寄主的防御反應PTI和ETI，表明近等基因系TcLr27+31在抵抗小麥葉銹菌的侵染過程中行使多種防御系統。另外，胼胝質積累隨效應因子激發時間的延長而增加，由圖8可見注射效應因子72 h的積累量顯著高于12 h的積累量。而活性氧迸發較胼胝質積累更早發生，是因為在防御反應PTI的過程中也會有活性氧的產生，并且活性氧是體內一類氧的單電子還原產物，是電子在未能傳遞到末端氧化酶之前漏出呼吸鏈并消耗大約2%的氧生成的，包括氧的電子還原產物超氧陰離子（O2-）、H2O2、羥基自由基（·OH）以及NO等。文中使用的NBT是用來檢測O2-的，O2-極其不穩定，會與H2O結合形成H2O2，在小麥上表達效應蛋白5 d后觀察到H2O2（圖7）。

在小麥條銹菌效應蛋白的研究中發現PstGSRE1定位于細胞質和細胞核，在胞內起作用，能夠抑制寄主活性氧積累，小麥鋅指結構轉錄因子TaLOL2是其靶標蛋白，TaLOL2能夠促進小麥活性氧積累，是小麥抗條銹病的正向調控因子，而PstGSRE1通過干擾并阻止TaLOL2進核，抑制寄主免疫反應從而利于病菌的侵染[44]。本研究通過亞細胞定位分析發現Pt18906在細胞內起作用，但其作用靶標及作用方式還有待于進一步研究。

SEGOVIA等[47]發現Pt3和Pt27可分別在含有抗性基因Lr9或Lr24，Lr26的近等基因系表現出對GUS的抑制作用，推測具有對Lr9或Lr24，Lr26的無毒性。本研究發現，效應蛋白Pt18906可促進寄主細胞中胼胝質的積累，在近等基因系TcLr27+31上引起活性氧的迸發，并激發壞死反應，表明Pt18906在TcLr27+31上具有無毒作用，并能夠觸發寄主TcLr27+31的防御反應PTI和ETI。本研究利用全套的抗葉銹病近等基因系進行效應蛋白相應功能的分析，發現該效應蛋白能夠在TcLr27+31和TcLr42上誘導產生壞死反應，在其他測試的進等基因系上無誘導壞死反應，而且缺少近等基因系TcLr27和TcLr31，因此，說明該效應蛋白與Lr27或Lr31，Lr42上發生了直接或間接的作用，但不能確定該基因對應的抗病基因是Lr27或Lr31。本研究只涉及了Pt18906在TcLr27+31上引起的胼胝質以及活性氧情況，而在TcLr42上未進行相關試驗，有待于后續完成。

4 結論

效應蛋白Pt18906是一個具有223個氨基酸的小分子蛋白，作用于細胞內，信號肽不具有分泌活性，在與小麥互作的初期發生顯著的上調反應。能夠有效抑制Bax和INF1激發的細胞程序性死亡，其28—47位氨基酸對其毒性功能具有重要作用。能夠激發小麥TcLr27+31胼胝質的積累和活性氧的迸發，TcLr27+31對Pt18906表現免疫反應。