山東省小麥田播娘蒿對雙氟磺草胺抗性水平及靶標抗性機理

高興祥，張悅麗，李美，李健，房鋒

（山東省農業科學院植物保護研究所，濟南 250100）

0 引言

【研究意義】隨著雙氟磺草胺（florasulam）在我國冬小麥田的大面積應用，部分區域已發現小麥田主要闊葉雜草播娘蒿（Descurainia sophia）對雙氟磺草胺的敏感性降低，在田間造成防治效果下降的現象，研究播娘蒿對雙氟磺草胺的抗性水平和抗性機理，對制定抗性雜草區域性治理技術具有重要意義。【前人研究進展】播娘蒿是我國小麥田常見的一種惡性闊葉雜草，在華東、華北、東北、西北等地區均有分布，是黃淮海冬小麥田最主要的越年生闊葉雜草，在河南[1]、山東[2]和河北[3]等省發生優勢度均居于前三位。播娘蒿因其莖葉伸展侵占面積大，與禾本科作物小麥競爭有效資源占盡優勢，嚴重影響小麥產量和品質[4-5]，對播娘蒿的抗性研究主要集中于其對苯磺隆（tribenuron-methyl）的抗性，據報道播娘蒿抗苯磺隆主要是基因位點突變，第197、376和574位發生突變，且以197位點發生突變為主，約占90%[6]。雙氟磺草胺是美國陶氏益農公司在20世紀90年代中期開發成功的第5個三唑嘧啶磺酰胺類除草劑新品種[7]，對小麥田幾乎所有的闊葉雜草包括播娘蒿、薺菜、豬殃殃等均有很好的防除效果[8]，是繼苯磺隆之后在小麥田用量最大的除草劑[9]，并可與植物生長調節劑、殺菌劑、其他除草劑等混用，現在黃淮海冬小麥田防除闊葉雜草的配方中幾乎都有雙氟磺草胺這一成分[10]，但該藥劑在我國應用多年后，對部分區域播娘蒿等闊葉雜草防治效果已明顯下降。關于小麥田闊葉雜草對雙氟磺草胺抗性報道不多，馬鵬生[11]報道了部分豬殃殃種群對雙氟磺草胺產生一定抗性，也有抗苯磺隆的薺菜種群對雙氟磺草胺產生交互抗性的報道[12]，但均無抗性機理報道，而另一種重要闊葉雜草播娘蒿未見抗雙氟磺草胺報道。【本研究切入點】筆者在田間調查時發現，因為雙氟磺草胺具有殺草譜廣、用量少等優點，近幾年在小麥田推廣面積很大，部分區域已發現用量在提高，防治效果下降現象，這很可能與播娘蒿對雙氟磺草胺產生抗性有關。【擬解決的關鍵問題】在山東省冬小麥田主產區采集播娘蒿種子40份，采用整株生物測定法，研究播娘蒿種群對雙氟磺草胺和對比藥劑苯磺隆、2甲4氯（MCPA）3種除草劑的抗性水平，并對高抗雙氟磺草胺播娘蒿種群進行靶標抗性位點測定，為小麥田雜草抗藥性精準治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

播娘蒿種子：2017年5月于山東省17地（市）小麥田采集自然成熟的播娘蒿種子，裝入牛皮紙袋，種子自然晾干后儲藏柜低溫儲藏。種群名稱以采集點所在地級市的首字母縮寫命名（表1）。

除草劑：98%雙氟磺草胺原藥，沈陽科創化學品有限公司；95%苯磺隆原藥，江蘇省激素研究所股份有限公司；95% 2甲4氯原藥，江蘇輝豐生物農業股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗性水平測定 試驗于2018年2—4月進行，在玻璃溫室中進行播娘蒿試材的培養，光照為自然光，溫度靠暖氣調整，試驗期間溫室溫度為14—28℃。每個采集樣點的播娘蒿為一個種群，在直徑為9 cm的塑料盆中單獨種植，覆土1—2 mm，每個種群種植64盒，將塑料盒放入裝有水的搪瓷盤中，以盆缽底部滲灌方式澆水，每隔3 d澆水一次，保持土壤濕度。

表1 40個播娘蒿種群采集地點Table 1 Collection sites information of 40 D.sophia populations

抗性測定采用盆栽整株劑量-反應測定法[4]。根據預試驗，每種除草劑設置5個劑量，其中雙氟磺草胺劑量為0.37、1.11、3.33、10.0、30.0 g·hm-2；苯磺隆劑量為5、20、80、320、1 280 g·hm-2；2甲4氯劑量為22.2、66.7、200、600、1 800 g·hm-2，每個種群均設置單獨空白對照，每處理4次重復，于播娘蒿3—6葉期，采用ASS-4型自動控制噴灑系統進行藥劑噴霧，噴頭為扇形噴頭，噴霧壓力為0.35 MPa，用水量按照每公頃450 L計算。

施藥后，觀察同一種藥劑下，40個播娘蒿種群的敏感差異，詳細記錄播娘蒿表現癥狀、表現時期以及不同種群的敏感差異。施藥后30 d，用剪刀剪取各種群各處理播娘蒿地上部分，稱量鮮重，每個種群根據相應的空白對照鮮重，計算鮮重抑制率。鮮重抑制率（%）=100×（空白對照鮮草重-處理區鮮草重）/空白對照鮮草重。

1.2.2 ALS基因突變分析 根據播娘蒿ALS基因序列（GenBank：FJ715633），設計引物（DS-F 5′ GGTA TCAAATCCCGTGCTCT 3′和DS-R 5′ CATATGCA TACAATCACCGGTT 3′），擴增片段包含目前已報道所有抗性相關位點。參照1.2.1的方法進行播娘蒿高抗種群植株的種植，待播娘蒿長到3—4葉時，采集藥劑處理后存活植株的單株葉片，采用植物基因組提取試劑盒（TaKaRa）提取基因組DNA，具體提取方法參照試劑盒相關流程；PCR克隆（25 μL反應體系，參數為94℃ 3 min；95℃ 30 s，53℃ 45 s，72℃ 2min，30個循環；72℃ 10 min）其ALS基因序列，使用UNlQ-10 DNA純化試劑盒（上海生工生物工程有限公司）回收PCR產物并送上海生工生物工程有限公司測序。將測序后獲得序列與擬南芥敏感型ALS基因和氨基酸序列進行比對，查找相關突變位點。每個種群檢測10株。

1.3 數據分析

用DPS 7.05軟件對藥劑劑量的對數值與鮮重抑制率的概率值進行回歸分析，得到劑量-反應曲線、相關系數、抑制雜草生長50%的除草劑劑量（GR50）及95%置信區間。由于不同種群本身種子活力、生長勢等有差異，所以相對抗性指數（resistance index，RI）＜5.00的均認定為敏感種群，RI=GR50（R）/ GR50（S），其中GR50（R）為抗性種群的GR50值，GR50（S）為敏感種群的GR50值。抗性判斷參考高興祥等[4]：1.00≤RI＜5.00為敏感種群，5.00≤RI＜10.00為低抗性種群，10.00≤RI＜50.00為中抗性種群，RI≥50.00為高抗性種群。

2 結果

2.1 播娘蒿對雙氟磺草胺抗性水平測定

雙氟磺草胺藥效表現較慢，施藥后7 d播娘蒿開始出現黃化，而后生長被抑制，至藥后15 d后開始死亡。40個播娘蒿種群中大部分種群對雙氟磺草胺敏感，但BZ-1、DZ-3、LC-3、LY-4、YT-1 5個種群敏感性明顯低于其他種群。

施藥后30 d調查結果統計（表2）可見，雙氟磺草胺對大部分播娘蒿種群效果很好，最敏感種群是DY-1和JNI-4，GR50均為0.11 g·hm-2，敏感種群有32個，占80.00%，抗性種群有8個，占總種群數的20.00%，部分種群抗性已很明顯。其中低抗、中抗和高抗種群數量分別為3、3和2個，各自占總種群數的7.50%、7.50%和5.00%。從山東省不同區域來看，對雙氟磺草胺產生抗性的播娘蒿種群分布無明顯規律，8個抗性種群分布于7個地（市），最高抗性種群為DZ-3，RI為194.00。

2.2 播娘蒿對對比藥劑苯磺隆和2甲4氯的抗性水平測定

苯磺隆藥效表現與雙氟磺草胺差別不大，施藥后7 d播娘蒿開始出現黃化，而后生長被抑制，至藥后15 d后開始死亡。表3為苯磺隆施藥后30 d調查結果。40個播娘蒿種群敏感性差異明顯，對苯磺隆最敏感的播娘蒿種群是HZ-1，GR50為0.56 g·hm-2，另外，DY-1、DZ-1、JN-2、WH-1等20個種群也比較敏感，RI＜5.00，敏感種群占52.50%；抗性種群有19個，占總種群數的47.50%，而且在抗性種群中，低抗、中抗、高抗種群分別為11、6、2個，分別占總種群數的27.50%、15.00%、5.00%。最高抗性種群是DZ-3，RI為244.75。

2甲4氯施藥后觀察，播娘蒿表現速度快，施藥后3 d時播娘蒿即開始出現扭曲，葉片不伸展，藥后7 d時莖葉開始黃化，而后逐漸死亡。40個播娘蒿種群對2甲4氯均敏感，效果無明顯差異。表4為2甲4氯施藥后30 d調查結果。2甲4氯對40個播娘蒿種群效果均很好，無明顯抗性產生，RI在1.00—5.00，且大部分在3.00以下。

表2 播娘蒿種群對雙氟磺草胺抗性水平測定Table 2 Resistance level of D.sophia populations to florasulam

表3 播娘蒿種群對苯磺隆抗性水平測定Table 3 Resistance level of D.sophia populations to tribenuron-methyl

表4 播娘蒿種群對2甲4氯抗性水平Table 4 Resistance level of D.sophia populations to MCPA

2.3 雙氟磺草胺高抗種群ALS基因突變分析

對雙氟磺草胺產生高抗種群BZ-1和DZ-3進行了ALS基因測序，測序分析結果顯示兩個高抗播娘蒿植株均發生了ALS基因功能位點的突變，但是突變位點或突變方向存在差異。BZ-1 ALS基因第197位氨基酸發生CCT（Pro）到TCT（Ser）或CTT（Leu）的突變，DZ-3 ALS基因第574位氨基酸發生了TGG（Trp）到TTG（Leu）的突變（表5）。

表5 高抗種群ALS基因突變分析Table 5 Analysis of ALS gene mutations in highly resistant populations

3 討論

3.1 播娘蒿對雙氟磺草胺及對比藥劑苯磺隆、2甲4氯的抗性水平

1988年美國杜邦公司的苯磺隆在我國正式登記，我國小麥田除草劑進入一個飛速發展期，但苯磺隆連續多年使用后，小麥田播娘蒿[13-16]、薺菜[17-20]、豬殃殃[21-23]、麥家公[24-25]等闊葉雜草的抗性逐年加重，苯磺隆單劑逐漸退出市場，僅作為復配制劑的成分之一。本研究中，播娘蒿對苯磺隆的抗性仍然很普遍，抗性種群占47.50%，最高相對抗性指數為244.75。

雙氟磺草胺是繼苯磺隆之后在小麥田應用最廣的防除闊葉雜草的除草劑，該藥劑與苯磺隆一樣，均屬于ALS抑制劑類除草劑，目前市場上防除小麥田闊葉雜草的除草配方中，雙氟磺草胺已成為一種必不可少的成分，該藥劑由于用量低、活性高，且對小麥安全性高，已大面積應用，國內學者對雙氟磺草胺以及復配制劑的應用進行了大量報道[8,10]，但隨著用藥時間延長，效果逐漸下降，用藥量逐漸加大，已是最初登記用量的3倍甚至更高，已有報道小麥田豬殃殃對雙氟磺草胺產生一定程度的抗性[11]，但未有小麥田主要雜草播娘蒿對雙氟磺草胺的抗性報道，對雙氟磺草胺產生抗性也沒有引起足夠的重視。從本試驗結果可見，雖然僅有20.00%的播娘蒿種群對雙氟磺草胺產生抗性，但兩個高抗種群BZ-1和DZ-3的相對抗性指數分別達到了52.00和194.00。

本試驗中播娘蒿種群未對對比藥劑2甲4氯產生抗藥性，2甲4氯在小麥田也主要應用于防除播娘蒿、薺菜，因此以播娘蒿、薺菜為主的地塊，可以使用2甲4氯等不易產生抗藥性的激素類藥劑進行防除，多種闊葉雜草混生地塊，可采用多種作用機制的除草劑混合使用或者交替使用[26-29]，減少雙氟磺草胺單一藥劑的使用。

綜合山東省播娘蒿40個種群對雙氟磺草胺和對比藥劑苯磺隆、2甲4氯的抗性水平測定結果，2甲4氯為激素類除草劑，40個播娘蒿種群未發現抗性產生，這也進一步印證了激素類除草劑不易產生抗藥性。雙氟磺草胺和苯磺隆為ALS抑制劑類除草劑，也是容易產生抗性的除草劑類型，從結果可以看出，抗雙氟磺草胺和抗苯磺隆的播娘蒿種群存在著一定程度的一致性，但又不是完全一致。抗雙氟磺草胺種群有8個，抗苯磺隆種群有19個，其中抗雙氟磺草胺的8個種群中有7個也是抗苯磺隆種群，如高抗雙氟磺草胺的播娘蒿種群BZ-1和DZ-3同時也是中抗和高抗苯磺隆種群；中抗雙氟磺草胺種群LC-3、LY-4、YT-1同時分別為中抗、高抗和低抗苯磺隆種群；低抗雙氟磺草胺的種群JN-1、JNI-2同時也是中抗苯磺隆種群，只有低抗雙氟磺草胺的種群LY-2對苯磺隆沒有抗性。其他抗苯磺隆的12個種群未見對雙氟磺草胺的抗性。

3.2 播娘蒿對雙氟磺草胺的抗性機理

靶標抗性機理和非靶標抗性機理是雜草對ALS類除草劑產生抗性的兩大原因[6,30-31]。靶標ALS基因突變或代謝作用增強是報道最多的ALS類除草劑抗性機理，國內外大量研究證實ALS存在8個抗性突變位點，分別為第122位丙氨酸、第197位脯氨酸、第205位丙氨酸、第376位天冬氨酸、第377位精氨酸、第574位色氨酸、第653位絲氨酸和第654位甘氨酸[32-34]，任一位點發生氨基酸替代均可導致雜草抗藥性的產生。本試驗結果表明，靶標突變是播娘蒿種群BZ-1、DZ-3對雙氟磺草胺產生高水平抗性的重要原因之一，種群BZ-1和DZ-3均發生ALS關鍵位點突變，但突變方式存在差異，這進一步證實了ALS突變的多樣性[6]。BZ-1的ALS基因第197位氨基酸發生了CCT（Pro）到TCT（Ser）或CTT（Leu）的突變，而DZ-3的ALS基因則是第574位氨基酸發生了TGG（Trp）到TTG（Leu）的突變，這一結果與鄧維[6]報道的關于播娘蒿對苯磺隆靶標抗性突變的3個位點（197、376和574位）研究結果具有一定的一致性，但突變方式不一樣。至于二者抗性機理的關聯性，有待進一步研究。非靶標抗性機理比靶標抗性復雜[28,35]，這方面的研究報道較少。非靶標抗性機制是盡量減少除草劑到達目標部位的數量，從而減少除草劑對雜草的損傷，目前有關非靶標抗性機理報道最多的是植物代謝能力的增強。播娘蒿對雙氟磺草胺抗性機理除了主要的靶標抗性外，是否還有非靶標抗性是下一步研究的重點內容之一。

4 結論

山東省40個播娘蒿種群中已有20.00%的種群對雙氟磺草胺產生明顯抗性，其中高抗種群的BZ-1和DZ-3相對抗性指數已高達52.00和194.00，且主要為靶標抗性。另外，播娘蒿種群對對比除草劑苯磺隆的抗性仍很普遍，對另一種激素類除草劑2甲4氯未產生抗性。因此，針對冬小麥田播娘蒿發生區域，不能單一使用雙氟磺草胺，應推廣多種作用機理的除草劑交替、混和使用，從而延緩和控制雜草產生抗藥性，同時擴大殺草譜、降低除草劑使用量。