貴陽(yáng)花溪久安茶樹(shù)炭疽病病原菌(Colletotrichun gloeosporioides)的分離鑒定及生物學(xué)特性

雷嬌嬌 田力 袁偉

摘要：為明確貴陽(yáng)花溪久安茶樹(shù)炭疽病的病原菌，利用組織分離法和柯赫氏法則對(duì)病原菌進(jìn)行分離與驗(yàn)證，利用形態(tài)學(xué)與rDNA-ITS對(duì)致病菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)致病菌的生物學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)研究。結(jié)果表明，引起久安茶樹(shù)炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌（Colletotrichun gloeosporioides）;生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明，C. gloeosporioides適宜生長(zhǎng)條件：在溫度為28 ℃的條件下，以O(shè)A培養(yǎng)基和SNA培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，半光照，pH值為5～7，以乳糖作碳源，以牛肉膏作氮源。通過(guò)本研究明確了花溪久安茶炭疽病病原，可以為該地區(qū)茶樹(shù)炭疽病病害流行及防控提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù);炭疽病;病原菌分離;生物學(xué)特性;膠孢炭疽菌

中圖分類號(hào)：S435.711 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）11-0100-06

收稿日期：2019-05-29

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)創(chuàng)新性示范基地建設(shè)（編號(hào)：091821104022292027-4）;貴州大學(xué)“SRT計(jì)劃”項(xiàng)目[編號(hào)：貴大SRT字（2018）293號(hào)];貴州省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃[編號(hào)：貴大（省）創(chuàng)字2019（155）]。

作者簡(jiǎn)介：雷嬌嬌（1995—），女，貴州織金人，主要從事林木病理學(xué)相關(guān)研究。E-mail：980435499@qq.com。

通信作者：于 存，博士，講師，主要從事森林病理學(xué)相關(guān)研究。E-mail：chifengyucun@163.com。 ?近年來(lái)，貴州省大力發(fā)展茶產(chǎn)業(yè)，至2019年茶樹(shù)種植面積約已達(dá)50萬(wàn)hm2[1]。而且隨著2019年兩會(huì)代表孫志剛在審議政府工作報(bào)告中提到“要喝沒(méi)有污染的茶到貴州來(lái)”，可見(jiàn)茶葉產(chǎn)業(yè)在貴州經(jīng)濟(jì)發(fā)展及扶貧攻堅(jiān)中起到了重要的作用。在貴州省的茶樹(shù)集中連片栽植過(guò)程中，有大量病蟲害發(fā)生，對(duì)茶產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的威脅。貴州省茶樹(shù)主要病蟲害包括茶餅病、茶白星病、茶圓赤星病、茶輪紋葉枯病、茶輪斑病、茶煤病、茶炭疽病等[2-3]。其中，茶葉炭疽病是茶樹(shù)重要的葉部病害之一，該病害的發(fā)生可引起茶葉部壞死、影響茶的光合作用、嚴(yán)重者導(dǎo)致其死亡。以往的報(bào)道中有關(guān)茶樹(shù)炭疽病病原菌的種類主要包括山茶刺孢菌（Colletotrichun camelliae）、雕刻刺盤孢菌（C.carveri）、馬尤斯刺盤孢菌（C.majus）、殼皮炭疽菌（C.crassipes）、膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）、果生刺盤孢菌（C.fructicola）、暹羅刺盤孢菌（C.siamense）、尖孢炭疽菌（C.acutatum）、河南刺盤孢菌（C.henanense）、江西刺盤孢菌（C.jiangxiense）等[4]。不同病原菌在引起植物發(fā)病的過(guò)程中受溫度、濕度、pH值、碳源、氮源等環(huán)境因素的影響，明確病原菌的生物學(xué)特性，可為防治該病害采取有效措施奠定基礎(chǔ)[5]。

貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)久安鄉(xiāng)位于黔中腹地，久安鄉(xiāng)土壤呈酸性，有機(jī)成分含量高，非常適合茶樹(shù)生長(zhǎng)，是適宜生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)有機(jī)生態(tài)茶葉的地方[6]。2013年，久安鄉(xiāng)生態(tài)精品茶示范園區(qū)被列入“5個(gè)100工程”，截至2015年，建成面積為666.67 hm2的規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化、設(shè)施完善的特色精品茶園。近年來(lái)，隨著茶園面積的不斷擴(kuò)大，加之茶園被列入歐盟有機(jī)認(rèn)證和雨林認(rèn)證，不允許使用化學(xué)農(nóng)藥防治病蟲害的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致久安鄉(xiāng)茶園內(nèi)病蟲害頻發(fā)。近年來(lái)，久安鄉(xiāng)茶場(chǎng)茶樹(shù)炭疽病發(fā)生較嚴(yán)重，而茶樹(shù)炭疽病致病菌種類仍未明確，因此，開(kāi)展該地區(qū)茶樹(shù)炭疽病致病菌鑒定及病原致病性研究對(duì)于當(dāng)?shù)夭鑸@茶樹(shù)炭疽病病害防治具有重要意義。本研究將從形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)對(duì)茶樹(shù)炭疽病病原菌進(jìn)行分離與鑒定，對(duì)其生物學(xué)特性作出探索，為進(jìn)一步了解久安鄉(xiāng)茶場(chǎng)的炭疽病病害防控提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

燕麥瓊脂（OA）培養(yǎng)基：30 g燕麥，20 g瓊脂，1 L 蒸餾水;合成低營(yíng)養(yǎng)瓊脂（SNA）培養(yǎng)基：1 g KH2PO4，2 g KNO3，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g KCl，20 g瓊脂，0.2 g葡萄糖，0.2 g蔗糖，1 L蒸餾水;馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 L蒸餾水;馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g蔗糖，20 g瓊脂，1 L 蒸餾水;茶汁培養(yǎng)基：20 g葡萄糖，3 g CaCO3，50 g 茶葉，20 g瓊脂，1 L蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶樹(shù)炭疽病病原菌的分離與驗(yàn)證 于貴陽(yáng)市花溪區(qū)久安鄉(xiāng)茶園采集患有炭疽病的5張典型葉片。利用組織分離法對(duì)5張病葉進(jìn)行病原菌的分離。將分離菌株離體回接至刺傷和未刺傷的茶樹(shù)葉片上，用脫脂棉進(jìn)行保濕在28 ℃條件下培養(yǎng)，以相同處理接種PDA菌餅的葉片作為對(duì)照。以上試驗(yàn)均重復(fù)5次。

1.2.2 茶樹(shù)炭疽病病原菌的鑒定 利用形態(tài)學(xué)與核糖體DNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）測(cè)序結(jié)合的方法對(duì)“1.2.1節(jié)”中可以引起茶樹(shù)炭疽病的病原菌進(jìn)行鑒定。利用形態(tài)學(xué)方法[7]，主要對(duì)病原菌菌落特征、顏色、菌絲及孢子大小等進(jìn)行觀察;rDNA-ITS鑒定參考李婕等的方法[8-9]，首先利用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，簡(jiǎn)稱CTAB）法提取致病菌總DNA，利用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行序列擴(kuò)增，得到序列后，通過(guò)NCBI的Blast進(jìn)行序列的比對(duì)分析，同時(shí)利用MEGA 7.0進(jìn)行包含致病菌ITS序列在內(nèi)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，綜合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的方法進(jìn)行病原菌的鑒定。

1.2.3 茶樹(shù)炭疽病病原菌生物學(xué)特性測(cè)定 分別將茶樹(shù)炭疽病病原菌菌株接種至不同培養(yǎng)基（OA培養(yǎng)基、SNA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、茶汁培養(yǎng)基），并設(shè)置不同碳源（麥芽糖、蔗糖、淀粉、果糖、乳糖）、不同氮源（尿素、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、牛肉膏、蛋白胨）、不同溫度（15、20、25、28、30、35 ℃）、不同光照（全光照、半光照、全黑暗）、不同pH值（4、5、6、7、8、9）。以上處理分別在培養(yǎng)3、4、5、6、7、8、9、10 d后測(cè)定菌落生長(zhǎng)半徑，分析不同因素對(duì)茶炭疽病病原菌生長(zhǎng)的影響。以上處理均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)炭疽病的分離及回接驗(yàn)證

茶樹(shù)炭疽病野外發(fā)病癥狀如圖1-a。茶樹(shù)炭疽病發(fā)生初期，在葉片上形成灰色病斑，病斑處凹陷，后期易破碎，病健交界處明顯。病斑上的小黑點(diǎn)即為分生孢子盤，寄生于葉片表皮下，后期分生孢子穿破表皮，隨風(fēng)雨飛散，作為病原物再次侵染茶樹(shù)[8]。利用組織分離法從5個(gè)不同發(fā)病茶葉中分離純化得到5株菌株，分別命名為TJ2-1、TJ2-2、TJ2-3、TJ2-4、TJ2-5。將5株菌株分別接種至刺傷和未刺傷茶樹(shù)葉片上，結(jié)果表明，在刺傷葉片上菌株TJ2-1可以引起茶樹(shù)炭疽病相同癥狀（圖1-b）。而在未刺傷葉片上5株菌株都未引起茶葉發(fā)病。對(duì)發(fā)病離體葉片采取組織分離法分離病原菌，同樣得到了與TJ2-1相同的菌株。由此可以確定菌株TJ2-1為茶樹(shù)炭疽病的病原菌。菌株 TJ2-1 主要通過(guò)傷口侵入到茶樹(shù)葉片內(nèi)引起發(fā)病。

2.2 茶樹(shù)炭疽病病原菌鑒定

病原菌在溫度為28 ℃，PDA培養(yǎng)基暗培養(yǎng)條件下，菌落生長(zhǎng)速度為0.9 cm/d，菌落白色至淺灰色，氣生菌絲較長(zhǎng)，毯狀，邊緣較整齊，背面一般會(huì)形成黑色物質(zhì)（圖2-a），培養(yǎng)后期于菌落中心產(chǎn)生橙黃色分生孢子堆。菌絲有隔（圖2-b），分生孢子橢圓形（圖2-c），兩端鈍圓，淺灰色，表面粗糙，中間凹陷，大小為（7.3～20.0 μm）×（2.0～5.0 μm）。分生孢子上易產(chǎn)生分生孢子附著孢，附著孢呈不規(guī)則形、球形，表面黑色或灰黑色，表面灰

色顆粒狀物明顯，大小為（6.1～10.2 μm）×（4.5～6.8 μm）。參照魏景超的《真菌鑒定手冊(cè)》以及邵力平等的《真菌分類學(xué)》等書籍，鑒定茶樹(shù)炭疽病病原菌屬于膠孢炭疽菌（Colletotrichun gloeosporioides）[10-11]。

擴(kuò)增菌株TJ2-1的rDNA-ITS獲得長(zhǎng)度為541 bp的分子序列，GenBank登錄號(hào)為MK757870。NCBI的Blast比對(duì)結(jié)果顯示，該序列與GenBank登錄號(hào)為KF836743.1的C. gloeosporioides的序列覆蓋度為100%，序列相似性為100%。由圖3可知，菌株TJ2-1的ITS序列與膠孢炭疽菌聚為一類，親緣關(guān)系較近，而與C. theobromicola菌株間遺傳距離較遠(yuǎn)，具有相對(duì)遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。由此結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定茶樹(shù)炭疽病致病菌為膠孢炭疽菌。

2.3 茶樹(shù)炭疽病病原菌生物學(xué)特性觀察

2.3.1 光照對(duì)膠孢炭疽菌生長(zhǎng)的影響 由圖4可知，在不同光照條件下，菌株均可生長(zhǎng)，在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，不同光照處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響差異不明顯。不同時(shí)間光照對(duì)膠孢炭疽菌生長(zhǎng)的影響結(jié)果顯示，在培養(yǎng)初期3～8 d時(shí)全黑暗條件下更有利于菌落生長(zhǎng)。而培養(yǎng)至9 d開(kāi)始，半光照更利于膠孢炭疽菌的生長(zhǎng)。不同光照及時(shí)間內(nèi)， 全光照對(duì)菌落

生長(zhǎng)均較全黑暗和半光照生長(zhǎng)緩慢。由此可見(jiàn)，茶樹(shù)常年處在高山多霧，日照少的自然條件下，是炭疽病嚴(yán)重發(fā)生的原因之一。

2.3.2 不同pH值對(duì)膠孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響 由圖5可知，在pH值為4～9時(shí)，菌絲均可生長(zhǎng)，在培養(yǎng)3～5 d時(shí)，pH值=7時(shí)更利于菌絲生長(zhǎng)，而在培養(yǎng) 6～10 d時(shí)適宜菌絲生長(zhǎng)的pH值范圍為 5～6。結(jié)合茶樹(shù)的生長(zhǎng)條件可知，在中性偏酸性的條件下更有利于膠孢炭疽菌的生長(zhǎng)。

2.3.3 不同氮源對(duì)膠孢炭疽菌生長(zhǎng)的影響 由圖6可知，以尿素作為氮源時(shí)，菌落在不同時(shí)間均沒(méi)有生長(zhǎng)。以牛肉膏作為氮源時(shí)，更利于菌絲的生長(zhǎng)，以硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、蛋白胨作為氮源對(duì)菌落生長(zhǎng)的促進(jìn)效果依次減弱。

2.3.4 不同碳源對(duì)膠孢炭疽菌生長(zhǎng)的影響 由圖7可知，在培養(yǎng)3～4 d時(shí)，不同碳源條件下菌絲長(zhǎng)勢(shì)基本一致。5 d以后，以乳糖和果糖作為碳源更利于菌絲的生長(zhǎng)。綜合評(píng)價(jià)不同碳源對(duì)膠孢炭疽菌生長(zhǎng)影響的排序?yàn)槿樘?果糖>麥芽糖>蔗糖>淀粉。

2.3.5 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由圖8可知，在培養(yǎng)初期OA培養(yǎng)基、SNA培養(yǎng)基更利于菌落

的生長(zhǎng)，在培養(yǎng)后期不同培養(yǎng)基對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響差異不明顯。綜合分析，不同培養(yǎng)基對(duì)膠孢炭疽菌生長(zhǎng)影響的排序?yàn)镺A培養(yǎng)基>SNA培養(yǎng)基>PSA培養(yǎng)基>PDA培養(yǎng)基>茶汁培養(yǎng)基。

2.3.6 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由圖9可知，在溫度為15～30 ℃范圍內(nèi)，膠孢炭疽菌均可生長(zhǎng)，而當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)菌落的停止生長(zhǎng)。在不同溫度范圍內(nèi)，28 ℃更利于膠孢炭疽菌的生長(zhǎng)，溫度由28 ℃逐漸降低或升高，膠孢炭疽菌的生長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)。因此，夏季是炭疽病流行的高發(fā)時(shí)期，應(yīng)注意病害的預(yù)防監(jiān)測(cè)。

3 討論與結(jié)論

貴州茶區(qū)普遍存在高海拔、多云霧、寡日照、氣候冷涼等特點(diǎn)，茶輪斑病、炭疽病等病害的發(fā)生與蟲害相比更為嚴(yán)重[12]。而對(duì)病害的有效防治須要準(zhǔn)確掌握引起病害的病原菌[13]。以往研究中報(bào)道的茶樹(shù)炭疽病病原菌主要為炭疽菌屬，本研究明確貴陽(yáng)花溪久安茶炭疽病病原為膠孢炭疽菌。對(duì)病原菌生物學(xué)特性的了解可以有助于從病原角度了解病害發(fā)生發(fā)展及指導(dǎo)防治措施的制定[14-15]。膠孢炭疽菌生物學(xué)特性結(jié)果表明， 不同溫度對(duì)膠孢炭

疽生長(zhǎng)的影響差異明顯，其中當(dāng)溫度為28 ℃時(shí)更利于菌株的生長(zhǎng)，當(dāng)溫度下降或上升均不利于菌株的生長(zhǎng)，由此推斷該病害更容易發(fā)生在 28 ℃ 左右的夏季，這與實(shí)際調(diào)查發(fā)現(xiàn)的該地區(qū)茶樹(shù)炭疽病多發(fā)生在夏季（夏季平均溫度為23～30 ℃）的結(jié)果相符。病原菌在引起病害過(guò)程中要經(jīng)歷接觸、侵入、潛育、發(fā)病等4個(gè)發(fā)病歷程，其中潛育期時(shí)間長(zhǎng)短決定了該病害發(fā)生周期的長(zhǎng)短，也決定了一種病害再侵染周期的長(zhǎng)短。而在病原菌潛育期過(guò)程中主要以吸收營(yíng)養(yǎng)，增加自身的生長(zhǎng)為主。因此，了解病原菌所需要的營(yíng)養(yǎng)條件，可以判斷其在不同條件下病原菌生長(zhǎng)的速度及潛育期的長(zhǎng)短，進(jìn)而合理地制定防治措施。在本研究中，膠孢炭疽菌以SNA培養(yǎng)基、OA培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，以乳糖作為碳源，以牛肉膏作為氮源，pH值為5～7時(shí)更利于其生長(zhǎng)，而不同光照處理對(duì)膠孢炭疽菌的影響差異不明顯，以初期黑暗條件，后期半光照條件更利于菌株的生長(zhǎng)，因此，可以將茶樹(shù)盡量種植在光照充足的地域以減緩茶樹(shù)炭疽病的發(fā)生。通過(guò)本研究明確了貴陽(yáng)花溪久安茶樹(shù)炭疽病的病原及其生物學(xué)特性，為該地區(qū)今后茶樹(shù)炭疽病的有效防治奠定了基礎(chǔ)，可以為今后該病原菌的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院. 貴茶十講[N]. 貴州日?qǐng)?bào)，2019-03-20（12）.

[2]施 利，江 健，王 勇，等. 貴州茶樹(shù)病蟲害防控現(xiàn)狀及對(duì)策建議[J]. 茶葉，2015，41（3）：146-149，153.

[3]劉 霞，江 健，詹金碧，等. 湄潭縣危害茶樹(shù)的主要病蟲害調(diào)查[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（9）：77-80.

[4]韓長(zhǎng)志. 炭疽菌屬真菌分類研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，2015，35（6）：24-30.

[5]朱迎迎，李 敏，高兆銀，等. 火龍果炭疽病病原菌的鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，47（1）：59-66.

[6]汪圣洪，胡嘉歡，周博楊. 貴陽(yáng)花溪久安茶葉園區(qū)氣候適宜性分析及減災(zāi)對(duì)策[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（30）：176-179.

[7]Weir B S，Johnston P R，Damm U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex[J]. Studies in Mycology，2012，73（1）：115-180.

[8]李 婕，李永川，楊 虹，等. 甘蔗黑腐病病原菌的鑒定[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，36（1）：139-143.

[9]劉小玉，余鳳玉，付登強(qiáng)，等. 油茶炭疽病病原菌的分離與鑒定[J]. 中國(guó)果菜，2018，38（11）：40-42.

[10]魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

[11]邵力平，沈瑞祥，張素軒，等. 真菌分類學(xué)[M]. 北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1984.

[12]劉 威. 茶樹(shù)炭疽病的病原鑒定及其遺傳多樣性分析[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2013.

[13]王珊珊，乜蘭春，李 潘，等. 植物病原真菌毒素的分類、致病機(jī)制及應(yīng)用前景[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（3）：94-97.

[14]文小東，宋星陳，王 勇，等. 茶輪斑病病原菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）生物學(xué)特性研究[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，2018，38（10）：19-25.

[15]陳全助，陳慧潔，郭文碩，等. 桉樹(shù)焦枯病菌（Calonectria pseudoreteaudii）生物學(xué)特性測(cè)定[J]. 福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，34（4）：328-332.呂中偉，吳文瑩，張 柯，等. 水溶肥施肥模式對(duì)陽(yáng)光玫瑰葡萄養(yǎng)分含量及果實(shí)品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（11）：106-111.