我國首株兔出血癥病毒2型的致病性及病理學初步研究

范志宇 陳萌萌 胡波

摘要：為深入研究國內首次發現并鑒定的兔出血癥病毒2型（RHDV2）四川分離株SC2020/04的致病性，用SC2020/04 RHDV2分離株，以皮下注射方式感染25日齡仔兔和4月齡成年兔，記錄家兔發病情況，對病死兔進行剖檢，并取肝臟樣品進行血凝（HA）和核酸檢測，取心、肝、脾、肺、腎、十二指腸等組織制作病理切片，進行病理學研究。試驗結果顯示，感染后仔兔18 h出現死亡，成年兔40 h出現死亡，死亡率均為5/5;感染后試驗兔出現典型兔瘟臨床癥狀，瀕死時四肢抽搐、角弓反張，部分死亡兔可見口鼻流出紅色血液;剖檢主要病變為肝臟腫大并伴有明顯的小葉樣改變，脾腫大，肺、肝、脾和腎出現充血和彌漫性瘀點出血，腹腔內有血樣滲出物;血凝試驗結果顯示，病死仔兔和成年兔肝臟血凝效價沒有明顯差異;采用鑒別經典RHDV/RHDV2的RT-PCR方法檢測攻毒死亡兔肝臟樣品，結果顯示為RHDV2陽性;病理學觀察可見多臟器嚴重出血、腫脹，淋巴細胞和中性粒細胞大量浸潤，病死仔兔十二指腸組織嚴重糜爛，成年兔十二指腸病變較輕。本研究對我國首個RHDV2毒株進行了致病性初探和病理學觀察，研究結果可以為RHDV2疫苗研發和致病機理研究奠定基礎。

關鍵詞：兔出血癥病毒2型;臨床癥狀;剖檢病變;病理學觀察

中圖分類號： S855.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0143-05

收稿日期：2020-05-20

基金項目：國家重點研發計劃（編號：2018YFD0502203）;現代農業產業技術體系建設專項資金（編號：CARS-43-C-1）。

作者簡介：范志宇（1982—），男，山西太谷人，博士，副研究員，主要從事家兔疫病防控技術研究，E-mail：fanzhiyu2007@163.com;共同第一作者：陳萌萌（1987—），女，江蘇連云港人，博士，助理研究員，主要從事家兔疾病防治與獸醫生物技術研究，E-mail：moonchen2010@yeah.net。

通信作者：王 芳，博士，研究員，主要從事家兔重要疫病致病機制及防控技術研究。E-mail：rwangfang@126.com。 ?兔出血癥（rabbit hemorrhagic disease，簡稱“RHD”）俗稱“兔瘟”，是由兔出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，簡稱“RHDV”）引起的一種急性、烈性、高致死性傳染病。經典RHDV只感染家兔，2月齡以上家兔易感，病死率可達90%，常于感染后48～72 h死亡，死亡兔以呼吸系統和肝、脾、腎、心等實質臟器瘀血、腫大和出血為特征，幼兔不易感[1]。2010年，在法國首次發現了RHDV的新毒株，命名為RHDV2或RHDVb，隨后該毒株蔓延到意大利、西班牙、葡萄牙、英格蘭、蘇格蘭和德國，在歐洲RHDV2取代經典RHDV的趨勢正在擴大[2-3]。在澳大利亞和亞速爾群島也有檢測到RHDV2的相關報道[4-5]。2020年4月，我國四川省發生疑似病例，經多種檢測方法確定病原為RHDV2[6]，這是我國首次發現RHDV2型毒株[7]，由此可見，RHDV2的流行趨勢正在世界范圍內逐步擴大。據OIE數據報道，當感染RHDV2時，7～15日齡的幼齡動物中也可以觀察到明顯的臨床癥狀和死亡，病死率可達90%。為了掌握我國首次發現的RHDV2型毒株的致病性和攻毒動物發病特征，本研究以25日齡仔兔和4月齡成年兔為攻毒對象，觀察攻毒后試驗兔的臨床癥狀、剖檢病變以及病理學變化，以期為RHDV2疫苗研發和致病機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

含兔出血癥病毒2型病死兔肝臟由江蘇省農業科學院獸醫所兔病學科團隊鑒定并保存[6]，命名為SC2020/04（GenBank登錄號：MT383749）;經典兔出血癥病毒對照RHDV皖阜株由筆者所在實驗室保存;陰性肝臟來自邳州市東方養殖有限公司的SPF兔。實驗兔購自江蘇省明天農牧科技有限公司，合格證號NO.202004338。

1.2 分離株感染試驗

1.2.1 感染用病毒制備 在生物安全柜中，剔除含RHDV2病死兔肝臟上結締組織，取少許肝臟，加入PBS后勻漿，使勻漿中含肝臟質量（g） ∶ PBS的體積（mL）為1 ∶ 10，反復凍融3次，以8 000 r/min離心30 min，取上清用0.22 μm濾器進行除菌，標記為SC2020F1備用。

1.2.2 實驗兔飼養管理 實驗兔飼養于負壓強毒攻毒動物房，試驗過程中注意人員的防護，產生的垃圾和動物尸體等經高壓滅菌后無害化處理，試驗結束后對環境進行徹底消毒。動物處理詳見《病害動物和病害動物產品生物安全處理規程》（GB 16548—2006）。

1.2.3 感染試驗觀察及取樣 將5只25日齡仔兔和5只4月齡成年兔分別頸部皮下注射SC2020F1，1 mL/只，使用監控設備觀察發病死亡情況，及時剖檢死亡兔并無菌取相關組織器官備用。

1.3 微量血凝試驗

取病死兔少許肝臟樣品，剪碎，按1 g ∶ 10 mL加入PBS后勻漿，反復凍融3次，以8 000 r/min離心 30 min，取上清進行微量血凝試驗，具體參照《兔病毒性出血病血凝和血凝抑制試驗方法》（NY/T 572—2016）。

1.4 死亡兔核酸鑒定

將死亡兔肝臟樣品與DEPC水按1 g ∶ 10 mL比例研磨成懸液，離心取上清，按照Trizol法提取RNA，利用反轉錄試劑盒獲得病毒cDNA，用筆者所在實驗室建立的鑒別經典RHDV/RHDV2的RT-PCR方法，以cDNA為模板，進行兔出血癥病毒VP60基因片段的擴增。經典RHDV擴增產物大小為193 bp，RHDV2擴增產物大小為829 bp。

1.5 病理學觀察

將無菌采集的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸等組織器官浸入4%多聚甲醛溶液中固定，經石蠟包埋、切片，進行H.E染色，在光學顯微鏡下觀察病理學變化并拍照;以無菌采集安樂死后健康25日齡仔兔和4月齡成年兔正常組織制作病理切片作為對照。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀

通過監控觀察發現，攻毒兔在注射病毒后12 h內有少量的采食和飲水行為，之后攻毒仔兔食欲、飲欲基本廢絕，成年兔采食和飲水次數比仔兔稍多，但采食量明顯下降，直至死亡。攻毒兔死亡前幾小時精神沉郁、呼吸困難、反應遲鈍，最緊急的病例在癥狀出現后1～2 h內迅速死亡，瀕死前表現有短暫的興奮，突然倒地，劃動四肢呈游泳狀，瀕死時四肢抽搐，用力蹬后肢，角弓反張，部分死亡兔可見口鼻流出紅色血液（圖1），肛門松馳，肛周有少量淡黃色黏液和糞便附著。

2.2 剖檢病變

剖檢可見各臟器有不同程度的腫脹、充血、出血，尤其是胸腺、肺臟、肝臟出現嚴重出血。鼻腔、喉頭和氣管黏膜、氣管環瘀血、出血，氣管和支氣管內有泡沫狀血液;胸腺出血，散在針頭大出血點;肺有不同程度充血、瘀血、水腫，切開肺臟流出多量紅色泡沫狀液體;肝臟瘀血、腫大、質脆，表面發黃，切面粗糙，切開流出大量暗紅色血液;脾臟瘀血、腫大，呈暗紅色;腎臟腫大，并見有大小不等的出血點，呈黑紫色;膀胱積尿，內充滿黃褐色尿液，部分病例尿液中混有絮狀凝塊。血液凝固不良，攻毒兔死亡后肺臟、肝臟等依然出血，胸腔和腹腔可見有未凝固的血液，死亡時間較長的在胸腔和腹腔有血凝塊（圖2）。

2.3 微量血凝試驗

頸部皮下注射SC2020F1毒株的10只家兔全部在72 h內死亡。用微量血凝試驗測定不同時間死亡的攻毒兔肝臟樣本血凝效價。結果顯示仔兔死亡時間明顯早于成年兔，死亡更快，病死仔兔和成年兔肝臟血凝效價沒有明顯差異（表1）。

2.4 核酸鑒定

以病毒cDNA為模板，使用經典RHDV/RHDV2鑒別引物進行擴增，結果顯示，10個攻毒死亡兔肝臟樣品在829 bp位置均出現單一的RHDV2的特異

性條帶，在193 bp位置未出現經典RHDV特異性條帶（圖3）。說明本試驗攻毒死亡兔全部由于感染RHDV2死亡，且沒有污染經典RHDV。

2.5 病理變化

對死亡仔兔和成年兔各臟器做石蠟切片，染色觀察結果見圖4和圖5。

攻毒死亡仔兔肝臟組織肝小葉結構不甚清晰，肝細胞索排列紊亂，肝細胞胞核染色質邊集，較多肝細胞胞質中可見大小不一的脂肪空泡（圖4-E 綠色箭頭）; 較多肝細胞點狀壞死，胞核碎裂、消失;個別匯管區周圍可見結締組織增生（圖4-E 藍色箭頭）。脾臟組織白髓數量明顯減少，殘留的白髓體積大小不一（圖4-D 黑色箭頭）;紅髓正常結構消失，大量纖維組織增生（圖4-D 綠色箭頭），缺少紅細胞和淋巴細胞。肺臟組織局部支氣管黏膜可見水腫和毛細血管充血，伴散在的炎性細胞浸潤;可見

少數幾處肺泡腔出血（圖4-C黑色箭頭）。腎小球毛細血管瘀血，少量毛細血管袢玻璃樣變（圖4-B綠色箭頭）;少量腎小管壞死（圖4-B紅色箭頭）;多數腎小管可見刷狀緣脫落（圖4-B黃色箭頭）。十二指腸組織嚴重糜爛，黏膜上皮細胞壞死、脫落（圖4-A 綠色箭頭），固有層裸露，毛細血管充血擴張（圖4-A黑色箭頭）;較多腺體結構消失（圖4-A藍色箭頭）;固有層底部可見少量炎性細胞浸潤（圖4-A 黃色箭頭），心臟未見明顯病變。仔兔與成年兔主要組織病理學差異是僅在仔兔中發現腸道病變。

攻毒死亡成年兔肝臟組織肝小葉結構不甚清晰，較多肝細胞點狀壞死（圖5-E黑色箭頭），胞核碎裂、消失;少量肝竇可見瘀血、出血;匯管區局部可見結締組織增生，伴散在的炎性細胞浸潤（圖5-E綠色箭頭）。脾臟組織白髓數量明顯減少，殘留的白髓體積減小（圖5-D黑色箭頭）;紅髓正常結構消失，可見大量嗜酸性纖維樣物質。肺細支氣管中可見巨噬細胞浸潤（圖5-C 藍色箭頭）;廣泛肺泡腔輕度增厚（圖5-C黑色箭頭）;小血管周圍可見少量炎性細胞浸潤（圖5-C綠色箭頭），有的可見血栓形成（圖5-C黃色箭頭）。腎小球毛細血管瘀血，少量毛細血管袢玻璃樣變（圖5-B綠色箭頭）;少量腎小管壞死（圖5-B紅色箭頭）;多數腎小管可見刷狀緣脫落，少量腎小管中可見嗜酸性細顆粒狀物質。十二指腸（圖5-A）和心臟（圖5-F）未發現明顯病變。

3 討論

在本研究中，中國分離株SC2020/04（RHDV2/GI.2）引起的臨床癥狀和剖檢病變與GI.1毒株引起的經典RHD非常相似，主要區別是40日齡以下家兔對經典RHDV不易感，哺乳仔兔不發病[8]，而RHDV2可引起仔兔發病死亡，OIE出版的《陸生動物疫苗和診斷手冊》指出7～15日齡的幼齡動物中可以觀察到明顯的臨床癥狀和死亡率，Dalton KP等[9]研究發現，RHDV2對11日齡及以上家兔即可感染致死，死亡兔伴有黃疸癥狀，但是SC2020/04毒株攻毒死亡兔并未發現有黃疸癥狀，可能與毒株致病力相關。與GI.1毒株相比，Dalton KP等[9]和le Gall-Recule等[10]研究指出GI.2可引起幼兔死亡，死亡率可達50%，OIE官方數據病死率可達90%。本研究結果顯示，仔兔和成年兔均在72 h以內全部死亡，仔兔平均死亡時間為25.6 h，成年兔平均死亡時間為54.8 h，死亡率均為5/5，說明SC2020/04毒株比歐洲較早報道的GI.2菌株致病性更強。因此，可以推測，SC2020/04毒株一旦在中國流行，將對養兔業產生嚴重危害甚至造成毀滅性打擊，相關疫苗研究刻不容緩。

RHDV作為一種嗜肝病毒，對肝臟組織具有明顯的致病作用。與以往所有關于RHD的研究一致，肝臟是SC2020/04的靶器官，表現出嚴重的病理損傷，組織肝小葉結構不甚清晰，較多肝細胞點狀壞

死，胞核碎裂、消失。總之，在仔兔和成年兔引起了與GI.1病毒相同的肝損傷。在成年兔和仔兔脾臟組織白髓數量明顯減少，殘留的白髓體積大小不一，這可能與病毒感染造成的淋巴細胞減少有關。Marques等發現感染兔肝臟和脾臟的淋巴細胞明顯減少[11]，Teixeira等也發現成年兔急性RHDV致死性感染中調節性T細胞也減少[12]。另外，仔兔和成年兔組織病理病變的主要差異是仔兔的十二指腸有明顯的病理損傷，而成年家兔不明顯，這可能與病毒受體表達、仔兔先天性免疫和腸道功能的改變有關[13-15]。

參考文獻：

[1]Abrantes J，van der Loo W，le Pendu J，et al. Rabbit haemorrhagic disease （RHD） and rabbit haemorrhagic disease virus （RHDV）：a review[J]. Veterinary Research，2012，43（1）：12.

[2]le Gall-Recule G，Zwingelstein F，Boucher S，et al. Detection of a new variant of rabbit haemorrhagic disease virus in France[J]. Vet Rec，2011，168（5）：137-138.

[3]王 芳，陳萌萌，宋艷華，等. 兔出血癥病毒新毒株RHDV2 的流行與控制（綜述） [J].江蘇農業科學，2016，44（ 9）：1-3.

[4]Strive T，Piper M，Huang N，et al. Retrospective serological analysis reveals presence of the emerging lagovirus RHDV2 in Australia in wild rabbits at least five months prior to its first detection[J]. Transbound Emerg Dis，2020，67（2）：822-833.

[5]Rouco C，Abrantes J，Serronha A，et al. Epidemiology of RHDV2 （Lagovirus europaeus/GI.2） in free-living wild European rabbits in Portugal[J]. Transbound Emerg Dis，2018，65（2）：e373-e382.

[6]魏后軍，胡波，范志宇，等. 兔出血癥病毒2 型的分離鑒定與序列分析[J]. 江蘇農業學報，2020，36（ 2）：404-409.

[7]Hu B，Wei H J，Fan Z Y，et al. Emergence of rabbit hemorrhagic disease virus 2 in China in 2020[J]. Authorea，May 06，2020. DOI：10.22541/au.158880187.76685134.

[8]王 芳，范志宇，薛家賓. 兔病圖鑒[M]. 北京：中國農業科學技術出版社，2019：68-84.

[9]Dalton K P，Nicieza I，Abrantes J，et al. Spread of new variant RHDV in domestic rabbits on the Iberian Peninsula[J]. Vet Microbiol，2014，169（1-2）：67-73.

[10]le Gall-Recule G，Lavazza A，Marchandeau S，et al. Emergence of a new lagovirus related to rabbit haemorrhagic disease virus[J]. Vet Res，2013，44：81.

[11]Marques R M，Teixeira L，Aguas A P，et al. Immunosuppression abrogates resistance of young rabbits to rabbit haemorrhagic disease （RHD）[J]. Vet Res，2014，45：14.

[12]Teixeira L，Marques R M，Aguas A P，et al.Regulatory T cells are decreased in acute RHDV lethal infection of adult rabbits[J]. Vet Immunol Immunopathol，2012，148（3/4）：343-347.

[13]Ruvoen-Clouet N，Ganiere J P，Andre-Fontaine G，et al. Binding of rabbit hemorrhagic disease virus to antigens of the ABH histo-blood group family[J]. J Virol，2000，74（24）：11950-11954.

[14]Kopecky J，Grubhoffer L，Kovar V，et al. A putative host cell receptor for tick-borne encephalitis virus identified by anti-idiotypic antibodies and virus affinoblotting[J]. Intervirology，1999，42（1）：9-16.

[15]Neimanis A，Pettersson U L，Huang N N，et al.Elucidation of the pathology and tissue distribution of Lagovirus europaeus GI.2/RHDV2 （rabbit haemorrhagic disease virus 2） in young and adult rabbits （Oryctolagus cuniculus） [J]. Vet Res，2018，49：46. 陳賽賽，鄭亞婷，郭容利，等. 幾株偽狂犬病病毒的增殖特性與保存條件[J]. 江蘇農業科學，2020，48（11）：148-152.