兩種酒精灌胃方案誘導大鼠酒精性肝損傷模型的比較研究*

胡 昊 李 寧 宋圓圓 王 博 龔志強 楊 艷

1 西南醫科大學公共衛生學院預防醫學專業，四川省瀘州市 646000； 2 西南醫科大學公共衛生學院衛生檢驗與檢疫教研室

酒精性肝病是由于長期大量飲酒而導致的肝臟損傷。隨著人們生活水平提高，酒精性肝病發病率逐年升高[1]，目前對酒精性肝損傷的研究主要集中于探討其致病經歷、預防措施以及藥物治療的篩選[2-3]。穩定可靠的酒精性肝損傷動物模型是研究其致病機理和防治措施的基礎條件[4]。大鼠酒精性肝損傷模型同人類酒精性肝病發病機制相似，可為研究酒精性肝病發病機制提供幫助[5]。目前，國內常用的酒精灌胃誘導酒精性肝損傷模型的方案主要有兩種：一種是類似黃玉軍等人以高度白酒或酒精以固定劑量持續灌胃2～8周誘導酒精性肝損傷模型的方法[6-7]，即固定酒精灌胃造模；另一種是屈勝勝等人用高度白酒或酒精持續灌胃6～12周造成大鼠酒精性肝損傷[8-10]，第1周或前幾周固定某一劑量(一般為6～8ml/kg)，以后每周或每幾周按某一劑量逐漸增加直至12～15ml/kg，即梯度酒精灌胃造模。但兩種模型的動物存活情況以及肝損傷程度是否有差異尚不清楚。實驗以大鼠的體重、存活情況以及肝損傷程度等作為指標來比較固定酒精灌胃法和梯度酒精灌胃法誘導的酒精性肝損傷大鼠模型的差異，為后續對大鼠肝損傷分子機制和防治藥物的篩選提供簡便、穩定、可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物材料:SPF級雄性SD大鼠40只，體重180～200g，由西南醫科大學實驗動物中心提供，飼養于西南醫科大學實驗動物中心。實驗動物生產許可證SCXK(川)2018-17；實驗動物使用許可證SYXK(川)2018-065。

1.1.2 主要儀器與試劑:5810 R冷凍型臺式大容量高速離心機(德國eppendorf公司)；Versamax連續波長酶標儀(美國分子儀器公司)；LD4-2A型臺式低速離心機(北京眾益中和生物技術有限公司)；HH-8數顯恒溫水浴鍋(中國常州國華電器有限公司)。56°紅星二鍋頭酒(北京紅星股份有限公司)；谷丙轉氨酶(Alanine transaminase，ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate transaminase，AST)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、總膽固醇(Serum total cholesterol，TC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒精肝損傷大鼠模型建立:適應性喂養1周后，將40只SD大鼠隨機分為3組：對照組10只，兩灌胃造模組各15只。采用白酒56°紅星二鍋頭灌胃8周建立酒精性肝損傷大鼠模型，兩種灌胃方案為：一種固定10ml/kg的劑量灌胃，通過固定酒精灌胃造模，該組簡稱固定組；一種以7ml/kg劑量灌胃為基礎，每2周按2ml/kg遞增，通過梯度酒精灌胃造模，該組簡稱梯度組。兩組大鼠酒精平均劑量相等，總量相當。大鼠每日灌胃1次。對照組用生理鹽水10ml/kg灌胃。

1.2.2 標本采集、制備和指標檢測:末次灌胃后，禁食12h，用1%戊巴比妥鈉4ml/kg麻醉大鼠，腹主動脈采血，取得的血液靜置1h，3 000r/min離心10min取血清。取血后立即處死大鼠，取肝臟用生理鹽水漂洗，濾紙拭干，迅速取部分肝組織，10%的福爾馬林液固定，包埋并切片，HE染色，光鏡下觀察。精確稱量肝組織塊制備10%的勻漿液，3 000r/min離心10min取上清液。按試劑盒說明書檢測血清ALT、AST、TG、TC和肝勻漿MDA、SOD。

2 結果

2.1 大鼠死亡情況 40只大鼠共有31只完成實驗，建模成功21只。通過解剖死亡動物來排除灌胃技術問題，則其余樣本死亡應是動物對酒精敏感引起。動物死亡情況及原因分析見表1。梯度組大鼠酒精敏感死亡率為6.67%(1/15)，固定組大鼠酒精敏感死亡率為26.67%(4/15)。

表1 兩種灌胃方案的大鼠死亡情況及原因分析(n)

2.2 大鼠體重變化 各組大鼠體重變化情況見圖1。實驗中對照組大鼠體重持續增長，梯度組大鼠體重第1～6周與對照組比較無明顯差異(P>0.05)，前3周體重持續增長，從第4周開始，增速緩慢，到第6周體重達到高峰，7、8周體重下降且顯著低于對照組大鼠(P<0.05)；固定組大鼠體重增長緩慢，除第3周，各周體重顯著低于對照組大鼠(P<0.05)。實驗第1～5周，梯度組大鼠體重顯著高于固定組大鼠(P<0.05)，第6周至實驗結束，兩模型組大鼠體重差異無統計學意義。實驗結束時，兩模型組大鼠體重均顯著低于對照組(P<0.001)。

圖1 兩種灌胃方案誘導的大鼠模型體重變化

2.3 各組大鼠肝臟組織病理學變化 光鏡下可見：對照組大鼠肝小葉結構完整，形態清晰，肝索排列整齊，呈放射狀，肝竇正常。梯度組和固定組大鼠肝小葉界限不清，肝細胞體積增大，輕微腫脹，胞質疏松、淡染，核濃縮，出現彌漫性大小不等的脂肪空泡，兩模型組組織病理學變化程度無顯著差異。

2.4 各組大鼠血清ALT、AST、TG、TC的變化 兩模型組大鼠血清ALT、AST、TG、TC均高于對照組(P<0.05)。梯度組大鼠血清ALT、AST、TG、TC均高于固定組(P<0.05)，見表2。

表2 兩種灌胃方案誘導的大鼠模型血清ALT、AST、TG、TC變化

2.5 各組大鼠肝臟MDA、SOD的變化 兩模型組大鼠肝臟MDA均顯著高于對照組(P<0.05)，SOD均顯著低于對照組(P<0.001)。固定組大鼠肝臟MDA顯著低于梯度組(P<0.05)，SOD顯著高于梯度組(P<0.001)，見表3。

表3 兩種灌胃方案誘導的大鼠模型肝勻漿MDA、SOD變化

3 討論

酒精性肝損傷模型建立的方法多樣，模型效果也參差不齊[11]，到目前為止國內尚未建立一種標準的評價大鼠酒精性肝損傷模型的方法。因為在建立酒精性肝損傷模型時，觀察指標多為數個，在評價時還需對多因素、多指標及其強弱進行綜合評定，不斷改良模型，以期發現更理想的動物模型。實驗以大鼠的體重、存活情況以及肝損傷程度等為指標來比較固定酒精灌胃法和梯度酒精灌胃法誘導的酒精性肝損傷大鼠模型的差異，以篩選簡便、穩定、可靠的動物模型造模方法。

實驗利用兩種方案誘導大鼠酒精性肝損傷，造模8周，肝臟均出現肝細胞腫脹和脂肪組織沉積等病理變化，體重下降，大鼠血清ALT、AST活性及TG、TC 含量均顯著升高，肝臟MDA升高，SOD降低，這些都符合酒精性肝損傷的變化特點[12-14]，表明兩種方案造模的大鼠均出現明顯酒精性脂肪肝，肝組織發生氧化損傷。但與固定組比較，梯度組大鼠血清ALT、AST、TG、TC升高，肝臟MDA升高，SOD降低(P<0.05)，表明梯度酒精灌胃法建立的大鼠模型生化指標變化更顯著。實驗中，梯度組大鼠以7ml/kg、9ml/kg、11ml/kg白酒灌胃期間，體重與對照組無差異，以13ml/kg白酒灌胃時體重下降且顯著低于對照組；而固定組大鼠以10ml/kg白酒灌胃，第1周的體重顯著低于對照組，除第3周，各周體重顯著低于對照組。這說明酒精影響食欲、抑制體重增長與酒精劑量有關，酒精達一定劑量才會影響食欲從而抑制大鼠體重，從體重變化圖可估計大鼠酒精性肝損傷的酒精閾劑量在9～11ml/kg之間。實驗第7周至結束，固定組與梯度組大鼠體重均顯著低于對照組，但兩組間體重無差異，病理學改變也無差異，說明兩組大鼠灌胃方案不同，影響實驗過程中的體重變化，酒精平均劑量相等且總量相當，最終體重和病理學改變無差異。

酒精持續灌胃8周，對實驗操作人員灌胃技術要求高，同時由于大鼠對酒精的敏感度有個體差異，造模中往往因為灌胃技術問題或大鼠酒精敏感度高而導致大鼠意外死亡。兩模型組共有9只大鼠死亡，通過死亡動物解剖，發現4只是灌胃時酒精誤入氣管所致，5只可能是酒精敏感死亡所致(解剖發現肝臟明顯腫大，充血)。梯度組大鼠酒精敏感死亡率為6.67%，固定組為26.67%，固定組大鼠酒精敏感死亡率相對高，這與固定組酒精劑量始終高于大鼠酒精性肝損傷的閾劑量且持續時間長有關。而梯度組大鼠生化指標變化比固定組更顯著，也是由于后4周酒精劑量高于大鼠酒精性肝損傷的閾劑量，特別是最后2周13ml/kg酒精灌胃劑量遠高于大鼠酒精性肝損傷的閾劑量，造成肝功能嚴重損傷。

梯度酒精灌胃方案誘導的酒精肝損傷大鼠模型體重增長被抑制，血清ALT、AST 活性，TG、TC 含量，肝臟MDA顯著升高，肝臟SOD顯著下降，肝臟出現肝細胞腫脹和脂肪組織沉積等病理變化。相對固定酒精灌胃，梯度酒精灌胃大鼠酒精敏感的死亡率低，生化指標變化更顯著，因此更適合用于酒精性肝病分子機制的研究和防治藥物的篩選。