骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15基因與卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者卵巢儲備功能的關系*

胡新新 林如茵 施琦蓉 陳彩虹 高宏志

福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，福建省泉州市 362000

骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)是目前發(fā)現(xiàn)的一種主要的卵源性因子，同屬于轉化生長因子p(TGF-p)超家族，在卵泡正常發(fā)育、排卵和卵母細胞成熟過程中都發(fā)揮重要的調節(jié)作用[1-2]。為探討B(tài)MP15在卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者刺激周期卵母細胞成熟過程中的表達變化及意義，本研究對91例患者(其中35例為卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者)卵母細胞BMP15的表達情況進行檢測，旨在探討B(tài)MP15基因與卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者卵巢儲備功能的關系。

1 資料與方法

1.1 資料來源 選擇2016年1月—2017年6月在醫(yī)院生殖醫(yī)學中心就診的、因男方因素不孕而接受ICSI治療的91例患者，其中卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者35例(觀察組)和卵巢功能正常的婦女56例(對照組)。對照組婦女的入選標準為：月經(jīng)規(guī)律(月經(jīng)周期為21～35d)，基礎體溫測試證實有正常排卵，超聲證實卵巢形態(tài)正常，雄激素水平正常，且基礎卵泡刺激素(FSH)水平<10U/L，體質指數(shù)(BMI)在18.5～23.0范圍之內(nèi)。兩組排除標準為：合并卵巢功能早衰、內(nèi)異癥、高泌乳素血癥、甲狀腺功能異常等；曾接受過卵巢手術或放化療者；近3個月內(nèi)接受過促排卵治療或服用性激素者。本研究方案經(jīng)本院倫理委員會批準，并且所有患者簽署知情同意書。兩組患者的一般情況見表1。

表1 兩組婦女的一般情況比較

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案：所有觀察對象均采用標準長方案，即在上1個月經(jīng)周期的黃體中期用促性腺激素釋放激素的激動劑(GnRH-a)進行垂體的降調節(jié)，在本次月經(jīng)周期的第2、3天用重組人卵泡刺激素(rhFSH)啟動，啟動劑量為75～300IU/d，并根據(jù)年齡、竇卵泡數(shù)目、基礎FSH水平以及以往治療周期的卵巢反應性進行劑量調整；之后每3～4天經(jīng)陰道B超監(jiān)測卵泡的生長情況，并同時監(jiān)測血清黃體生成素(LH)、雌二醇和孕酮的水平，以此調節(jié)促性腺激素(Gn)的劑量。當有1個卵泡直徑達18mm或2個卵泡直徑達17mm或3個卵泡直徑達16mm時，當日停用rhFSH，單次臀部肌內(nèi)注射hCG 10 000U，34～36h后經(jīng)陰道超聲引導下取卵[3-4]。

1.2.2 巢式實時定量：以β肌動蛋白(β-actin)的表達水平作為參照。探針序列為BMP15：5’-FAM-TGGCATATACAGATCCTGGGCTTT-TAMRA-3’；β-actin：5’-FAM-CACCACGGCCGAGCGGGA-TAMRA-3’。第1輪PCR反應條件為：93℃5min，93℃30s，55℃45s，72℃45s共30個循環(huán)，72℃延伸7min。第2輪PCR反應條件為：93℃3min，然后93℃30s，55℃45s，共40個循環(huán)。每例標本均重復檢測3次，取其均值用于統(tǒng)計分析。以目的基因與β-actin的吸光度(A)的比值表示BMP15 mRNA的相對表達水平[5]。

1.3 統(tǒng)計學方法 所得數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析。兩組患者臨床資料的比較采用t檢驗；由于部分數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，故采用非參數(shù)檢驗的秩和檢驗方法，以中位數(shù)(M)和第25及第75百分位數(shù)表示。

2 結果

對照組刺激周期卵母細胞BMP15 mRNA的表達水平GⅤ期高于MⅠ期，MⅠ期低于MⅡ期，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。組間比較，觀察組BMP15在GⅤ期顯著低于對照組(P<0.01)。見表2。

表2 兩組刺激周期不同成熟階段卵母細胞BMP15 mRNA的表達[M，(P25，P75)]

3 討論

本研究結果顯示，在非卵巢內(nèi)膜異位囊腫且卵巢功能正常婦女卵母細胞成熟的不同階段，BMP15 mRNA的表達水平均呈現(xiàn)顯著性變化，在成熟階段表達水平最高[6-8]。王鶴[9]利用原位雜交技術檢測了人類從始基卵泡到小竇卵泡階段卵母細胞中BMP15 mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)在卵泡生長的早期階段，卵源性因子的表達強度逐漸增加，與本研究結果一致，值得注意的是，MⅠ期卵母細胞中BMP15 mRNA的表達水平與GV期和MⅡ期比較均較低，與甘霏霏等[10]的結果不一致，MⅠ期卵母細胞的主要變化是生殖泡裂解和減數(shù)分裂重新啟動，由此推測，在胞核劇烈變化的過程中，胞質內(nèi)細胞因子的表達水平也發(fā)生相應變化，可能引起B(yǎng)MP15 mRNA表達水平的下降。

卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者在促排卵刺激下的卵母細胞隨著核發(fā)育成熟，BMP15的表達水平均未表現(xiàn)出動態(tài)性變化，且處于低水平狀態(tài)。該結果提示，卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者卵母細胞對外源性Gn反應低下，并存在胞質發(fā)育不成熟以及核質發(fā)育不同步[11-13]。本研究結果還發(fā)現(xiàn)，MⅡ期卵母細胞中BMP15的表達水平觀察組低于對照組，提示經(jīng)過促排卵的刺激，觀察組卵母細胞中卵源性因子的表達在成熟階段未能達到正常水平。一項類似研究發(fā)現(xiàn)[14]，在卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者成熟卵母細胞周圍的卵丘細胞中，GDF9的表達顯著低于正常水平；另外，該研究還采用免疫熒光的方法對卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者和卵巢功能正常婦女的未成熟卵母細胞進行檢測，分析了MⅠ期卵母細胞中BMP15的表達，發(fā)現(xiàn)BMP15在兩組婦女未成熟卵母細胞中的表達無明顯差異。由于卵源性因子參與卵母細胞和卵丘細胞的雙向調節(jié)，推測卵源性因子的表達水平降低可能影響卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者卵母細胞—卵丘復合體(OCC)的結構和功能，從而導致卵母細胞質量和發(fā)育潛能受損。由于本研究所用卵母細胞均來自卵巢刺激周期，與生理狀態(tài)下的卵母細胞可能存在差異[15]。生理狀態(tài)下卵母細胞中卵源性因子的表達是否也存在同樣的變化，需要在以后的研究中進一步驗證。

總之，在刺激周期中，卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者成熟卵母細胞中卵源性因子表達水平降低，可能影響細胞質成熟，從而導致卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者卵母細胞質量下降和發(fā)育潛能受損。