不同波長的藍光對人視網膜色素上皮細胞的影響

鞠雅晗，湯志敏，王宇瑤，代小嬋，羅 敏，谷 平

0引言

現代社會中，人們的工作和生活高度依賴于手機、電腦、電視等電子設備的使用，來源于這些電子設備顯示屏的光給人們的視覺健康帶來了極大的挑戰[1]。藍光(400～500nm)廣泛存在于電子顯示屏的顯示光譜(400～800nm)之中，是其主要的短波光譜[2]。近年來，藍光的視覺安全問題已經引起了人們的廣泛關注。研究表明，藍光對調節人體神經內分泌和晝夜節律有重要的影響[3]，然而，藍光對視覺系統安全性的影響也不容忽視。在眼內，低于400nm的短波紫外線可大部分被角膜和晶狀體吸收，而藍光可穿透晶狀體到達視網膜，造成視網膜的損傷[4-5]。年齡相關性黃斑變性(ARMD)是中老年人致盲的首要疾病[6]，研究表明，慢性光損傷是ARMD發病的重要高危因素之一[7]，然而視網膜光損傷與ARMD發病之間的具體聯系尚不明確。視網膜是視覺系統的核心組織，而視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)是整個視網膜功能正常運行的后勤保障細胞，RPE的功能障礙可隨后導致感光細胞的受損，進而導致視網膜病變[8-9]。因此，我們認為，RPE的損傷是整個視網膜光損傷的核心和源頭環節，所以深入探討RPE的損傷及其機制是研究視網膜光損傷的最佳切入點。本研究通過模擬電子顯示屏的低光強藍光照射體外RPE細胞，評估和比較不同波長的藍光對RPE細胞的活性、增殖能力、視循環功能相關指標及炎癥指標水平的影響，為今后藍光損傷研究和干預提供理論依據和基礎。

1材料和方法

1.1材料人視網膜色素上皮細胞(ARPE-19細胞系)購于中科院細胞庫；DMEM培養基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶(Gibco，美國)，CCK-8(cell-counting kit-8)試劑(Dojindo，日本)，活/死細胞染色試劑盒(Invitrogen，美國)，RNA提取試劑盒(EZ bioscience，中國)，反轉錄試劑盒(Takara，日本)；光學顯微鏡(Olympus，日本)，Real-time PCR儀(Applied Biosystems 7500，美國)，酶標儀(BioTek Instruments，美國)，CO2培養箱(Thermo Fisher Scientific，中國)，超凈工作臺(BIO-HAZARD，VCM-420，中國臺灣)。

1.2方法

1.2.1細胞培養用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基培養ARPE-19細胞株，將細胞培養于37℃，5% CO2的培養箱中，待細胞融合后用0.25%胰蛋白酶進行消化及傳代，取狀態良好的細胞用于實驗。

1.2.2細胞分組及藍光損傷模型建立將細胞隨機分為對照組和藍光組，其中對照組細胞進行正常培養；藍光組細胞暴露于可發出3個不同波段藍光的有機發光二極管(OLED)顯示設備下，3個波段藍光的峰值波長分別為447、456、468nm，藍光照度約為200Lx，光照距離為2cm，在細胞融合度為60%～70%時進行藍光照射，實驗過程中使用隔光板避免不同波長的藍光之間的干擾。處理完成后顯微鏡下觀察細胞形態并攝片記錄。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖活性取狀態良好的細胞消化并離心后，使用含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞，制成細胞懸液，以每孔8×103個細胞接種于96孔板，對照組細胞進行正常培養，藍光組細胞分別經相應波長的藍光照射0、24、48、72h，處理結束后，每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃細胞培養箱中孵育，4h后用酶標儀檢測450nm波長處的吸光度值(A)。細胞增殖活性=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.4活/死細胞染色檢測細胞活性取狀態良好的細胞接種于24孔板中，每孔4×104個細胞，將藍光組細胞置于447、456、468nm藍光下照射72h后，用PBS潤洗細胞，根據說明書配置活/死細胞染色試劑培養基，以每孔覆蓋細胞為準，孵育30min后，熒光顯微鏡下觀察檢測，顯示綠色熒光的為活細胞，顯示紅色熒光的為死細胞。

1.2.5 Real-time PCR檢測細胞mRNA表達變化對照組細胞進行正常培養，藍光組細胞置于447、456、468nm藍光下照射72h后，按照RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA，利用Nanodrop2000c測定RNA濃度后根據逆轉錄試劑盒說明書操作，將RNA逆轉錄成cDNA。根據PubMed檢索的核苷酸序列進行引物設計，引物由生工生物有限公司合成，引物序列見表1。反應條件：95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃退火1min，95℃延伸15s，擴增40個循環。Ki-67、單核細胞趨化因子(MCP-1)、白介素-6(IL-6)、卵磷脂視黃醇酰基轉移酶(LRAT)、視黃醛結合蛋白(CRALBP)、視黃醛脫氫酶(RDH)、光受體視黃醇類結合蛋白(IRBP) mRNA的相對表達量以GAPDH的表達為內部參照，結果采用2-△△Ct法計算，以對照組表達量的倍數形式呈現。

表1 引物序列

2結果

2.1不同波長的藍光對細胞增殖活性的影響CCK-8檢測結果顯示，將各時間點的檢測數據根據各組細胞藍光照射0h測得的吸光度值進行歸一化處理，與正常培養的對照組相比，光照24h后，各藍光組細胞的增殖活性略有減弱，但差異無統計學意義(均P>0.05)；光照48、72h后，藍光組各組細胞均有明顯的增殖活性抑制現象，差異均有統計學意義(P<0.01)。不同波長的藍光照射細胞不同時間(24、48、72h)后，細胞的生長速率和增殖活性均受到不同程度的影響，其中波長越短，對細胞的增殖抑制越明顯，細胞生長速率越緩慢(圖1A)。

增殖標志物Ki-67的表達水平可間接反應細胞的增殖能力。Real-time PCR結果顯示，藍光照射細胞72h后，藍光組各組細胞Ki-67 mRNA表達水平均降低，與對照組相比，447nm藍光組細胞Ki-67 mRNA表達下降最明顯，其次為456nm藍光組、468nm藍光組(圖1B)。綜上結果，提示波長越短的藍光對ARPE-19細胞的增殖活性影響越大。

圖1 不同波長的藍光對細胞增殖活性的影響

2.2不同波長的藍光導致細胞形態的變化顯微鏡下對細胞形態進行觀察，正常培養的ARPE-19細胞形態規則，細胞融合度良好，細胞之間緊密連接(圖2A)，藍光組細胞在不同波長的藍光照射72h后，細胞的形態發生變化，細胞融合不佳，細胞密度稀疏，其中447nm藍光組細胞形態變化最明顯(圖2B)，其次為456nm藍光組(圖2C)和468nm藍光組(圖2D)。

圖2 不同波長藍光照射后細胞的形態學改變(×100)

2.3不同波長的藍光對細胞活性的影響活/死細胞染色

結果顯示，與對照組相比，藍光組細胞在不同波長藍光照射72h時后可引起細胞不同程度的死亡(圖3)。在447、456、468nm波段中，藍光的波長越短，細胞的死亡數量越多，其中447nm藍光組細胞活性最差，提示短波長藍光對ARPE-19細胞活性影響最大。

圖3 不同波長的藍光照射對細胞活性的影響(×200)

2.4不同波長藍光對細胞視循環功能相關指標的影響Real-time PCR檢測各組細胞中卵磷脂視黃醇酰基轉移酶(LRAT)、視黃醛結合蛋白(CRALBP)、視黃醛脫氫酶(RDH)、光受體視黃醇類結合蛋白(IRBP) mRNA表達，結果顯示，藍光照射72h后，各視循環功能相關指標的基因表達均呈現不同程度的下降，其中最短波長447nm藍光照射后對細胞視循環功能指標的抑制作用最顯著(圖4)，表明短波長藍光對細胞的視循環功能影響最大。

圖4 不同波長的藍光對細胞視循環功能指標mRNA表達的影響

2.5不同波長藍光誘導細胞炎癥因子表達的變化Real-time PCR檢測結果顯示，藍光照射72h后，ARPE-19細胞中MCP-1和IL-6 mRNA表達水平均上調，其中447nm波長藍光照射后細胞中促炎因子上調最明顯(圖5)。

圖5 不同波長的藍光對細胞炎癥因子MCP-1和IL-6 mRNA表達水平的影響

3討論

隨著電子技術的發展，人們的工作和生活中越來越離不開手機、電腦、電視等電子設備的使用，來自這些顯示設備中的光，尤其是其中的藍光對人類健康的影響已經引起了廣泛關注。既往研究表明，藍光可以調節人的生物節律[10]。然而，藍光亦可損害我們的視覺系統。近年來，視網膜退行性疾病尤其是ARMD在發達國家的發病率正在逐年攀升[11]，這或許與人口老齡化的發展態勢有關，但也與人們對電子設備日益嚴重的依賴性有著不可分割的關系，增長的屏幕使用時長使視網膜暴露在更多的藍光之下，帶來潛在的視覺安全隱患。本研究使用模擬電子設備顯示屏照度的藍光進行體外研究，可有效評估日常工作生活中顯示屏藍光對人類視覺安全的影響。

RPE細胞是視網膜中最重要的細胞之一，具有多種生理功能，如分泌、吞噬、屏障功能等，其負責保障視網膜正常功能的運行[12]。RPE細胞的損傷或死亡通常被認為是ARMD等視網膜退行性疾病的核心環節[13]。本研究結果表明，藍光可造成RPE細胞的異常，包括形態改變，細胞活性下降，細胞增殖能力減弱，甚至可造成細胞的死亡，且隨著藍光波長的變短，其對RPE細胞的損傷作用越顯著。我們觀察到在短波長藍光照射下，RPE細胞顯示出更為稀疏的細胞融合度，這也從側面體現了RPE細胞的增殖能力減弱，通過CCK-8實驗以及增殖標志物Ki-67 mRNA水平的檢測結果加以證實，隨著藍光波長變短，藍光對RPE細胞的增殖抑制作用越強。此外，利用活/死細胞染色實驗清楚地看到不同波長的藍光照射下RPE細胞的存活情況，藍光的照射波長越短，RPE細胞中死細胞占總細胞的比例越大。

RPE的重要生理功能之一是視循環功能[14]，即視蛋白視黃醛的代謝，這是眼睛能感知到光的生理基礎。RPE細胞中表達多種關鍵的視循環功能基因，如RDH[15]、CRALBP[16]、LRAT[17]、IRBP[18]等，這些視循環功能蛋白均參與視黃醛代謝，負責其合成與轉運，RPE既是視黃醛的儲存場所又是其合成場所，因此，一旦這些關鍵的視循環蛋白發生異常，視黃醛的正常轉運和代謝就無法完成，視覺功能將因此受到損害。本研究發現，藍光照射后，RPE細胞視循環功能指標的基因表達水平明顯下降，意味著RPE細胞的視循環功能受損，其異常可能導致視覺障礙甚至失明。雖然ARMD病因仍然不明確，但是視黃醛代謝的障礙可能是其重要的誘導因素之一[19]。此外，RPE作為血-視網膜屏障的外部屏障起著重要的作用，因此RPE的功能障礙直接影響血-視網膜屏障的完整性，而RPE功能受損后繼而將受到炎癥攻擊，導致RPE炎癥指標的異常，從而誘導ARMD等視網膜退行性疾病的進展[20]。既往研究表明，RPE功能異常引起的炎癥反應是導致ARMD等視網膜退行性疾病的關鍵誘發因素[21]。本研究中發現，藍光可在體外誘導RPE細胞促炎因子MCP-1和IL-6 mRNA表達明顯上調，表明RPE的光損傷確實可造成其炎癥水平的異常。研究報道，促炎因子MCP-1等在視網膜退行性疾病(如ARMD)的發生發展中發揮了重要的作用[22]，提示光損傷后RPE異常的炎癥因子水平可能會導致ARMD等視網膜退行性疾病的發生。然而，本研究尚未對炎癥因子的異常表達機制進行研究，將在今后的研究中進行深入探討。

綜上所述，本研究結果表明藍光照射可引起RPE細胞的異常，包括細胞活性下降、細胞增殖能力減弱甚至細胞死亡。此外，藍光下調了RPE細胞視循環功能相關基因的表達，同時可引起RPE細胞的炎癥指標水平異常，表現為促炎因子IL-6和MCP-1的基因表達升高。與長波長藍光相比，短波長藍光對RPE細胞的損傷作用更明顯。本研究旨在觀察不同波長的藍光對維持視網膜功能的RPE細胞的損傷作用，探討對視覺系統損害的藍光波長的特點，為視網膜的藍光損傷研究提供了新的實驗依據，也為今后顯示設備視覺安全性的發展給予了一定的指導意義。