摘除淚腺和淚腺注射肉毒桿菌毒素A制備大鼠干眼模型的比較

董子奕，應 銘，楊 希，馬 伊

0引言

2015年國際干眼病工作組[1]全面修訂了對干眼病(dry eye disease, DED)的認識，認為DED是一種多因素導致的眼表疾病，特征是淚膜穩態的喪失并伴有眼表癥狀，水液不足型是常見的干眼亞型之一。炎癥因子是常見的致病因素之一[2-3]。隨著發病率的升高，干眼癥越來越得到重視[4]，建立穩定、高效的干眼癥動物模型成為了深入探索干眼癥發病機制和觀察治療效果的有力工具。在正常飼育環境下，建立水液不足型干眼癥動物模型主要有兩類手段：一類為手術干預，例如摘除淚腺、手術去勢等方法；另一類為藥物誘導，比如眼瞼涂抹阿托品眼膏、淚腺注射肉毒桿菌毒素等[5]。本實驗分別采用了摘除淚腺以及淚腺注射肉毒桿菌毒素A(botulinum toxin A,BTX-A)誘導大鼠干眼癥模型，對比兩種水液缺乏型干眼癥模型的臨床表現、病理學特點以及細胞因子變化，進而分析兩種干眼癥動物模型的優缺點和應用范圍。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與分組本研究中涉及大鼠的所有程序均經天津市人民醫院醫學倫理委員會批準，并符合《視覺與眼科研究協會(ARVO)關于動物用于眼科和視力研究的聲明》的指導方針。選取健康8周齡雄性Brown Norway(BN)大鼠30只(北京華阜康生物科技股份有限公司)，體質量200～250g，清潔級飼養。隨機分為3組，每組各10只，均選取左眼為實驗眼，第一組左眼不予任何處理作為空白組(A組)，第二組摘除左側主淚腺(B組)，第三組左側淚腺注射肉毒桿菌毒素A(C組)。A、B、C組各10眼。

1.1.2主要藥品和試劑注射用A型肉毒毒素：美國艾爾建制藥有限公司；淚液檢測酚紅棉線，熒光素鈉試紙：天津晶明新技術開發有限公司；動物組織總RNA提取試劑盒：北京賽百盛基因技術有限公司。引物設計：大連寶生物有限公司設計并合成引物。

1.2方法

1.2.1實驗動物模型建立A組大鼠左眼不做任何處理。制作摘除主淚腺干眼癥動物模型：將B組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4mL/kg)，待動物麻醉后，于左耳下約1cm處做縱行切口，左眼外側1cm處做橫行切口，暴露皮下見眶外淚腺，分離周圍組織，將其完整摘除，逐層縫合關閉傷口。制作淚腺注射肉毒桿菌毒素A干眼癥動物模型：將C組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4mL/kg)，待動物麻醉后在手術顯微鏡下暴露左側淚腺，淚腺注射肉毒桿菌毒素A 0.1mL(20mU)。將大鼠置于溫度為24℃±2℃，濕度為50%，早8∶00至晚8∶00照明，其余時間黑暗環境下飼養。

1.2.2干眼癥動物模型檢查項目分別于實驗前1d及實驗后3、7、14、28、42d，將大鼠進行基礎麻醉后檢測淚液分泌試驗(SⅠt)、淚膜破裂時間(BUT)以及角膜熒光染色評分并在照相裂隙顯微鏡下拍照記錄。淚液分泌試驗：根據Fujihara等[6]的試驗標準，將一張淚液分泌酚紅棉線放入大鼠下瞼外1/3處，1min后讀取條紋濕潤長度并精確到0.1mm。淚膜破裂時間：將10%熒光素鈉溶液滴于大鼠結膜囊內，使熒光素均勻分布于大鼠眼表面，固定眼瞼，通過裂隙燈鈷藍光觀察，記錄從最后1次閉眼開始至淚膜出現第1個破裂點時所需時間，取3次的觀察時間取平均值。熒光素鈉染色評分：將10%熒光素鈉溶液滴入大鼠結膜囊內，裂隙燈顯微鏡鈷藍光下觀察1min后角膜染色的情況并評分。參照Koh等[7]的方法，其評分標準如下：將角膜分為四個象限分別評分，分數相加為最終得分。0分：無著染；1分：點狀著染≤30個；2分：點狀著染>30個，但不彌散；3分：嚴重的點狀著染但不融合成片；4分：著染成斑片狀。所有檢查均由同一名檢查者在同一時間(AM9∶00～12∶00)，同一地點、溫度、濕度及照明情況下完成。

1.2.3病理學檢查實驗后第42d，隨機從每組中各取出2只大鼠過量麻醉處死，立即摘除左側眼球，A,C組摘除左側淚腺組織，4%多聚甲醛固定標本24h，然后用流水沖洗2h，蒸餾水沖洗30min，浸泡于100%、95%、80%、70%乙醇中各5min脫水，二甲苯溶液中透明，60℃石蠟包埋，連續切片，厚度為7μm，45℃攤片，60℃烤片，常規脫蠟入水，蘇木精染色試劑盒染色5min，然后用溫水沖洗3min，取出蘇木精。然后將其浸泡在含0.01% HCl的伊紅中1min，最后用自來水沖洗10min。同樣進行PAS染色，最后觀察角膜、結膜、淚腺的病理變化。

1.2.4實時熒光定量PCR(RT-PCR)測定上皮生長因子(EGF)、白細胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達量實驗后第42d，處死余下大鼠，分別取左眼結膜及角膜組織，使用動物組織總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測其純度和濃度，并進行逆轉錄獲取cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內參對照的校準基因(PCR擴增細胞的標志性基因)。引物序列：EGF上游引物為5’-TCGGTGCTGTGCGATTTA-3’,下游引物為 5’-TTTCTGGCAGTTCTCCTC-3’;IL-6上游引物為5’-CAGTTGCCTTCTTGGGACT-3’，下游引物為3’-GCTCTGAATGACTCTGGCTT-5’；TNF-α上游引物為5’-CACGTCGTAGCAAACCACCAA-3’，下游引物為3’-GTTGGTTGTCTTTGAGATCCAT-5’。采用SYBR green I作為熒光信號對以上指標進行聚合酶鏈式反應擴增，通過計算2-△△ct值取平均值繪制各指標表達量對比圖。PCR反應條件：95℃預變性10min；94℃ 15s、60℃ 1min，40個循環；95℃ 15s、60℃ 1min、95℃ 15s至反應結束。

2結果

2.1淚液分泌試驗實驗后第3d，B組與C組均出現淚液分泌量持續性減少，B、C組在第14d分別減少至3.83±0.41mm以及3.61±0.71mm，A組為7.34±0.31mm，與A組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，其后B、C組淚液分泌量維持穩定。B、C組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 A、B、C組淚液分泌試驗酚紅棉線長度測量比較

2.2淚膜破裂時間測定實驗后第3d，各組淚膜破裂時間未見差異改變(P>0.05)。第7d，B組與C組開始出現淚膜破裂時間縮短，B、C組淚膜破裂時間在第28d分別縮短為6.03±0.43、6.20±0.40s，A組為10.87±0.59s，與A組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，其后B、C組淚膜破裂時間維持穩定。B、C組間比較差異沒有統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 A、B、C組淚膜破裂時間檢測比較

2.3角膜染色評分A組角膜上皮光滑，經熒光素鈉染色后角膜上皮偶見獨立點狀著染，未見彌散的點狀著染(圖1A)。實驗后第7d，B、C組角膜上皮點染數量逐漸增多，提示角膜上皮粗糙，但未見明顯片狀融合，隨后B、C組角膜點染明顯增多，逐漸出現片狀染色(圖1B、C)。B、C組角膜評分在實驗后第28d分別為5.8±1.5、5.5±1.4分，A組為0.8±0.6分，與A組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，其后B、C組角膜評分維持穩定。B、C組間比較差異均無統計學意義(表3)。

圖1 第42d角膜上皮熒光素鈉染色

表3 A、B、C組角膜熒光素鈉染色評分結果 分)

2.4病理學檢查結果HE染色：A組角膜上皮細胞形態正常，排列整齊，上皮完整連續?；讓蛹毎帕芯o密，分布整齊(圖2A)。B、C組角膜上皮均存在不同程度表層細胞絲狀分離，角膜上皮細胞排列不規則，上皮點狀脫落，角膜基質細胞體積明顯增大，排列無序，胞核固縮，呈多角狀增生(圖2B、C)。A組正常淚腺可見腺泡規則，排列緊密，腺上皮細胞核正常、深染，胞漿淡染(圖3A)；C組萎縮淚腺可見腺泡不清晰，排列疏松，腺上皮細胞變性，細胞核消失，胞漿紅染(圖3B)。PAS染色：B、C組結膜杯狀細胞數目較A組明顯減少，胞體萎縮，體積減少，結膜上皮呈鱗狀化生(圖2D～F)。

圖2 HE和PAS染色

圖3 淚腺病理改變(×200)

2.5 RT-PCR結果先觀察熔解曲線，所有引物的熔解曲線均只出現單峰，說明反應具有特異性。結膜組織：細胞因子EGF、TNF-α和IL-6在B組及C組中表達量均顯著增高(F=10.78，P=0.001；F=32.48，P<0.001；F=30.80，P<0.001)，B、C組EGF表達量分別為A組的2.73±1.38倍和3.19±1.04倍；B、C組IL-6表達量分別為A組的4.96±1.63倍和2.17±0.75倍；B、C組TNF-α表達量分別為A組的3.96±1.34倍和3.74±0.70倍，差異均有統計學意義(P<0.05)；B、C組間比較，EGF及TNF-α的表達差異均無統計學意義(P=0.826、0.967)，IL-6表達差異有統計學意義(P=0.004)，見圖4A。角膜組織：細胞因子EGF、TNF-α和IL-6在B組及C組中表達量均顯著增高(F=12.86，P<0.001；F=17.39，P<0.001；F=60.15，P<0.001)，B、C組EGF表達量分別為A組的2.46±1.03倍和3.78±1.60倍；B、C組IL-6表達量分別為A組的6.95±1.35倍和4.25±1.31倍；B、C組TNF-α表達量分別為A組的4.35±1.90倍和4.16±1.13倍，差異均有統計學意義(P<0.05)；B、C組間比較，EGF及TNF-α的表達差異無統計學意義(P=0.196、0.993)，IL-6表達差異有統計學意義(P=0.003)，見圖4B。

圖4 RT-PCR結果

3討論

干眼癥的發生與淚液的分泌或蒸發異常密切相關[8]，而淚液通過瞬目運動涂抹在眼表形成一層超薄的淚膜，自外至內分成脂質層、水樣層和粘蛋白層，任何一層結構異常均可導致干眼癥的發生。大鼠的淚器包括淚腺、淚腺排出管及鼻淚管。主淚腺在激素和神經的調控下分泌出淚液，構成了淚膜水樣層的主要成分，因此摘除大鼠主淚腺可以制作干眼癥動物模型[9]。淚腺的神經支配非常豐富，通過來自于面神經的副交感神經和來自頸上神經節的細小交感神經纖維共同支配調節。肉毒桿菌毒素是一種嗜神經毒素，能夠抑制副交感神經末梢鈣離子介導的乙酰膽堿的釋放，有A～G7亞型，其中A型和B型最為常見。有報道證實淚腺注射BTX-B后淚腺腺泡發生去神經性萎縮，最終導致淚液分泌減少[10]，但此種方式構建的干眼模型存在穩定性差的缺點。BTX-A型最早使用于臨床，其藥物毒性比B型低，藥效持續時間比B型久，因此我們推測BTX-A注射淚腺后可以構建穩定的干眼模型。

淚腺摘除組和淚腺注射BTX-A組從實驗后第3d開始均出現了淚液分泌量持續性減少，第7d淚膜破裂時間開始持續性縮短，第28d達到最低點并維持穩定，角膜上皮變得粗糙糜爛，有熒光著染甚至潰瘍斑片出現，角膜上皮細胞排列不規則，上皮點狀脫落，結膜杯狀細胞數量明顯減少，BTX-A組的淚腺腺體嚴重萎縮，以上結果提示本實驗得到的模型均符合水液缺乏型干眼的臨床特點和病理學特征。淚腺摘除組和淚腺注射BTX-A組在第3d同時出現了淚液分泌量的減少，和既往研究中BTX-B造模后3d出現淚液分泌減少的結果相一致[5,10]，說明了BTX-A起效迅速，可以快速地引起淚腺的萎縮。Lin等[11]研究發現BTX-B干眼模型在造模28d后會出現淚液分泌量升高，模型存在欠穩定等缺點，可能和BTX-B藥物有效時間短，淚腺暫時性萎縮有關[5]，但本實驗的BTX-A組沒有出現這種現象，提示了BTX-A構建的干眼模型更加穩定。淚腺摘除組和淚腺注射BTX-A組組間比較沒有差異，說明這兩種造模方式構建的干眼模型在臨床表現的嚴重程度方面是沒有差別的。由此可見，本實驗中兩種方法構建的干眼癥模型是成功的。

越來越多的研究表明，炎癥在干眼的發病機制中起到了關鍵的作用[12]，多種炎癥因子[13]已被證實參與了干眼的病變過程，在損傷角膜上皮結構，破壞淚膜穩定性等方面扮演了重要角色，其中IL- 6和TNF-α尤為重要，它們同屬細胞因子網絡中的核心成員。IL-6是一種調節炎癥反應的細胞因子，是B細胞和T細胞功能的重要調節因子，干眼患者結膜上皮多種炎性因子增高，而IL-6是最有價值的[14]。RT-PCR結果顯示摘除淚腺組和注射BTX-A組IL-6因子表達量均明顯的提升，摘除淚腺組高于注射BTX-A組，此結果證實了淚腺缺如或淚腺萎縮可以引起IL-6的升高，并且猜測升高的程度可能和淚腺缺損程度呈正相關。TNF-α主要由巨噬細胞產生，具有廣泛的生物活性，可以改變多重靶細胞的功能，TNF-α是細胞黏附和趨化的主要介質，主要負責炎癥期間細胞遷移的調控。Oshida等[15]指出干眼患者淚液中TNF-α的濃度增高，且濃度高的患者熒光素染色評分高，這表明淚液中TNF-α含量與角膜上皮受損情況呈正相關，暗示TNF-α也是干眼癥發生的炎性介質。本實驗顯示兩個模型組的TNF-α因子表達量升高，且兩組間比較沒有差異，與熒光素鈉染色及病理學檢查結果相一致。由此證實，淚腺萎縮或缺如導致淚液分泌量減少，淚液滲透壓升高，進而激活IL-6和TNF-α介導的炎癥反應。

EGF是一種可以修復上皮組織，對抗損傷的因子。先前研究中發現EGF在干燥綜合征患者的淚液，淚腺或唾液腺中的表達明顯降低[16]，但也有證據[17-18]表明干眼導致的角膜損傷可以引起EGF的升高。本實驗兩種造模方式均可以引起EGF的升高，推測是否和主淚腺受損及角膜上皮損傷后的代償性反應相關，有待后續實驗進一步證實。目前對于EGF的評價呈兩極分化，一方面EGF可以促進角膜上皮傷口的愈合，另一方面EGF的升高可能與腫瘤相關。因此干眼癥中EGF的表達變化，是否采用EGF治療，如何使用EGF是安全有效的，這些問題值得進一步研究。

本實驗對比了兩種誘導水液缺乏型干眼癥動物模型的方法：摘除淚腺法模型表現穩定，缺點是手術會造成不可逆的淚腺缺如，并且手術創傷大，要求一定的手術技巧，此種模型適合于觀察人工淚液等代替治療的療效，但不適用于觀察針對于淚腺治療的效果；淚腺注射BTX-A制備的模型穩定性與淚腺摘除法相近，操作相對簡單，其導致的淚腺萎縮更貼合于人類疾病的特點，適合于藥物或干細胞修復淚腺功能以及治療角膜損傷等相關實驗。但BTX-A有一定的藥物毒性，是否對實驗動物造成其他不良影響有待于進一步觀察。每一種動物模型均有其優點，也有其弊端，因此在進行干眼病理及藥理研究的過程中，需根據實驗設計及實驗目的去選擇合適的動物模型。