miR-96-5p靶向FOXO4對高糖誘導的大鼠視網膜血管內皮細胞增殖和凋亡的影響

李 歡，路 璐

0引言

糖尿病視網膜病變是糖尿病并發癥中最嚴重的一種微血管病變，嚴重時可導致失明并降低患者生活質量，其發病機制尚未完全闡明，既往研究顯示血糖持續性升高是誘導患者視網膜病變的主要原因之一[1]。因此深入探究糖尿病視網膜病變發病機制可為臨床預防糖尿病患者發生視網膜病變提供理論指導。研究表明，微小RNA-96-5p(microRNA-96-5p，miR-96-5p)在2型糖尿病患者外周血中表達下調[2]。miR-96在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病小鼠心肌組織中表達下調并可能參與心肌細胞增殖及凋亡過程[3]。相關研究表明過表達miR-96可抑制宮頸癌細胞的增殖，促進細胞凋亡[4]。但miR-96-5p在糖尿病視網膜病變過程中的表達變化及其可能作用機制尚未見報道。靶基因預測軟件得到叉頭框轉錄因子O4(forkhead box O4，FOXO4)可能是miR-96-5p的靶基因，研究表明FOXO4在糖尿病視網膜中高表達，α-黑色素細胞刺激激素在抗視網膜內皮細胞氧化應激過程中表達下調[5-6]。高糖處理后的視網膜血管內皮細胞中FOXO4表達上調[7]。但miR-96-5p在高糖誘導的大鼠視網膜血管內皮細胞中的表達及其對大鼠視網膜血管內皮細胞增殖和凋亡的影響，且miR-96-5p是否通過調控FOXO4的表達影響大鼠視網膜血管內皮細胞的增殖和凋亡目前還尚未可知。因此，本研究通過體外培養SD大鼠視網膜血管內皮細胞(RRVEC)并構建高糖模型，觀察高糖誘導的RRVEC中miR-96-5p與FOXO4表達變化及其對RRVEC增殖、凋亡的影響，為早期防治糖尿病視網膜病變研究提供理論基礎，以期為臨床治療提供科學依據。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SD雄性大鼠10只，體質量200～220g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，合格證號：SCXK(濟)2012-0003。本研究經倫理委員會審批通過。

1.1.2主要試劑胰蛋白酶、Lipofectamine 2000均購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、RNA提取及反轉錄試劑盒購自美國Sigma公司；細胞培養基、IgG二抗均購自武漢博士德生物有限公司；GAPDH抗體購自杭州賢至生物有限公司；兔抗鼠B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關x蛋白(Bax)、cleaved-caspased-3抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗鼠FOXO4、CyclinD1、p21、p27抗體購自美國Santa Cruz公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所；細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；miR-96-5p模擬物(mimic)、無義miRNA(miR-NC)、FOXO4 siRNA(si-FOXO4)、FOXO4陰性對照序列(si-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA 3.1購自上海索寶生物科技有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自江蘇依萊薩生物技術有限公司。

1.1.3主要儀器設備ABI 7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；Multiskan Sky 酶標儀購自美國賽默飛公司；CytoFLEX流式細胞儀購自美國貝克曼公司。

1.2方法

1.2.1 SD大鼠視網膜血管內皮細胞培養與鑒定參照文獻進行RRVEC分離培養[8]。麻醉大鼠后用脫頸法處死大鼠，消毒后摘除大鼠眼球，用乙醇浸泡30s后使用預冷的PBS緩沖液沖洗3次，剪切視網膜組織并剪碎，放入培養液內，Ⅰ型膠原酶消化視網膜組織，30min后收集消化液，用100μm的網孔過濾消化液，經1500r/min轉速離心5min(離心半徑13cm)，棄上清，向沉淀物中加入DMEM培養基(肝素鈉、胎牛血清)，細胞接種至24孔板，置于37℃恒溫培養箱內培養，每隔2d更換1次培養液，RRVEC穩定傳代4代后接種于蓋玻片上(密度為1×104個/mL)，繼續培養24h，細胞貼壁生長后取出蓋玻片，采用免疫熒光染色法鑒定細胞，并置于熒光顯微鏡下觀察，分離的細胞均呈鋪路石樣單層貼壁生長，Cy3(紅色熒光)陽性表達。

1.2.2細胞轉染與分組收集生長狀態良好的RRVEC，將其分為對照組(NG)：葡萄糖濃度5.5mmol/L處理；高糖組(HG)：葡萄糖濃度30mmol/L處理[9]。分別采用miR-96-5p mimic、miR-NC、si-FOXO4、si-NC轉染高糖誘導的RRVEC，分為HG+miR-96-5p組、HG+miR-NC組、HG+si-FOXO4組、HG+si-NC組。通過轉染miR-96-5p mimic后再轉染pcDNA-FOXO4驗證miR-96-5p過表達是否通過抑制FOXO4表達進而促進高糖誘導的RRVEC增殖并抑制細胞凋亡，將細胞分為HG+miR-96-5p+pcDNA組、HG+miR-96-5p+pcDNA-FOXO4組。細胞轉染后放入37℃、5%CO2恒溫培養箱內培養，6h后更換為含有10%胎牛血清的新鮮培養基，繼續培養48h后收集對數生長期細胞進行后續研究。

1.2.3 qRT-PCR檢測細胞中miR-96-5p和FOXO4 mRNA表達水平采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測miR-96-5p、FOXO4 mRNA表達，分別設計miR-96-5p、FOXO4基因引物并由上海生物工程股份有限公司設計合成(表1)。用Trizol、酚/氯仿提取總RNA進行qRT-PCR反應，配置反應體系20μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10μL，cDNA 2μL，上下游引物各0.8μL，ROX Reference Dye(50×)0.4μL，ddH2O 6μL。反應條件：95℃ 5min循環1次，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40個循環。收集各樣本Ct值并采用2-ΔΔCt法計算miR-96-5p、FOXO4 mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.2.4 Western blotting檢測相關蛋白表達采用蛋白免疫印跡(Western blotting)檢測FOXO4、CyclinD1、p21、p27、Bcl-2、Bax、cleaved-caspased-3蛋白表達。取對數生長期RRVEC進行實驗處理后，預冷PBS洗滌2次，棄上清液，加入蛋白裂解液，孵育20min(冰上進行)，取細胞裂解液經轉速13000r/min離心20min，取上清并根據BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，20μg蛋白樣品加入上樣緩沖液，經10% SDS-PAGE電泳反應后用PVDF膜轉載分離蛋白，5%脫脂奶粉封閉1h，4℃條件下加入各蛋白一抗孵育過夜，次日用TBST清洗3次×10min，室溫條件下加入二抗孵育40min，TBST清洗3次×10min，滴加ECL發光液，置于成像系統觀察并用Image-Pro Plus軟件分析蛋白條帶灰度值，各蛋白相對表達量為目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值。

胡人進村了，大肆搜索，很快發現井下藏著人，胡人把吊桶拉了上來。農夫聽到胡人痛叫一聲，想是他去捉婦人，反被咬了一口，跟著婦人慘叫一聲，就再無聲息了。

1.2.5 MTT檢測細胞增殖收集細胞RRVEC，預冷PBS洗滌，用0.1%胰蛋白酶消化后加入培養液重懸細胞，調整細胞密度為5×104個/mL，根據實驗分組將細胞接種于96孔板(1%明膠包被)，置于37℃恒溫培養箱培養48h，根據分組條件處理結束前4h分別在每孔中加入20μL MTT試劑(5g/L)，放入37℃恒溫培養箱繼續培養4h棄培養液，加入DMSO(150μL/孔)，室溫振蕩10min后選取570nm波長的酶標儀檢測各孔吸光度值(OD570nm)，實驗均設置3次重復。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡采用流式細胞術Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡情況。取對數生長期RRVEC進行實驗處理后，收集各組細胞，0.25%胰蛋白酶消化，用PBS清洗后經1000r/min離心10min收集細胞，分別加入500μL Binding Buffer，加入5μL Annexin V-FITC充分混勻10min后加入5μL PI孵育5min，利用流式細胞儀檢測各組細胞熒光強度并計算細胞凋亡率。實驗設置3次重復。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗通過靶基因預測軟件確定miR-96-5p與FOXO4具有連續性結合靶點，分別設計含有miR-96-5p結合位點的FOXO4 3’UTR野生型熒光素酶報告基因載體(WT-FOXO4)，并設計FOXO4 3’UTR突變后的突變型熒光素酶報告基因載體(MUT-FOXO4)，將WT-FOXO4、MUT-FOXO4分別與miR-96-5p mimic或miR-NC共轉染RRVEC，置于37℃恒溫培養箱繼續培養48h后收集細胞并使用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測RRVEC的相對熒光素酶活性。

統計學分析：采用SPSS 21.0統計軟件分析實驗數據。Shapiro-Wilk檢驗數據均符合正態分布，經Levene檢驗方差齊性，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，若差異具有統計學意義，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1高糖處理對RRVEC中miR-96-5p和FOXO4表達的影響qRT-PCR與Western blotting分別檢測高糖處理后RRVEC中miR-96-5p和FOXO4表達變化，結果顯示，相較于NG組，HG組細胞中miR-96-5p表達水平顯著降低(t=17.191，P<0.05)，而FOXO4 mRNA(t=20.443，P<0.05)和蛋白(t=11.714，P<0.05)表達水平均顯著升高，見圖1。

圖1 高糖處理對RRVEC中miR-96-5p和FOXO4表達的影響

2.2 miR-96-5p過表達對高糖誘導的RRVEC增殖的影響采用miR-96-5p mimic轉染高糖誘導的RRVEC，qRT-PCR檢測結果顯示(圖2A)，HG+miR-96-5p組細胞miR-96-5p表達水平較HG+miR-NC組明顯升高(t=15.363，P<0.05)，表明成功提高高糖誘導的RRVEC中miR-96-5p表達水平。MTT檢測高糖誘導的RRVEC轉染miR-96-5p mimic 48h后細胞增殖能力變化，結果顯示(圖2B)，HG組細胞增殖活性顯著低于NG組(t=15.757，P<0.05)；HG+miR-96-5p組細胞增殖活性顯著高于HG+miR-NC組(t=13.377，P<0.05)，表明上調miR-96-5p表達可明顯促進高糖誘導的細胞增殖。Western blotting進一步檢測細胞增殖相關蛋白表達，結果顯示(圖2C、2D)，與NG組相比，HG組細胞中CyclinD1蛋白表達顯著降低(t=18.783，P<0.05)，而p21、p27蛋白表達水平顯著升高(t=16.100、15.757，均P<0.05)；與HG+miR-NC組相比，HG+miR-96-5p組細胞中CyclinD1蛋白表達水平顯著升高(t=19.498，P<0.05)，而p21、p27蛋白表達水平顯著降低(t=13.587、9.603，均P<0.05)，表明miR-96-5p過表達可能通過抑制p21、p27蛋白表達促進CyclinD1蛋白表達，進而促進細胞增殖。

圖2 miR-96-5p過表達對高糖誘導的RRVEC增殖的影響

2.3 miR-96-5p過表達對高糖誘導的RRVEC凋亡的影響流式細胞術檢測miR-96-5p過表達對高糖誘導的RRVEC凋亡的影響，結果顯示(圖3A、3C)，高糖處理后細胞凋亡率顯著高于NG組(t=31.778，P<0.05)，而轉染miR-96-5p mimic(HG+miR-96-5p組)后細胞凋亡率較HG+miR-NC組明顯降低(t=15.078，P<0.05)，表明高糖誘導可促進RRVEC凋亡，上調miR-96-5p表達可抑制高糖誘導的RRVEC凋亡。Western blotting檢測細胞凋亡相關蛋白表達，結果顯示(圖3B、3D)，HG組細胞Bcl-2蛋白表達水平顯著低于NG組(t=10.791，P<0.05)，而Bax、cleaved-caspased-3蛋白表達水平均顯著高于NG組(t=15.363、17.441，均P<0.05)；HG+miR-96-5p組細胞Bcl-2蛋白表達水平顯著高于HG+miR-NC組(t=10.804，P<0.05)，而Bax、cleaved-caspased-3蛋白表達水平均顯著降低(t=8.586、12.182，P<0.05)，表明miR-96-5p過表達可能通過上調Bcl-2蛋白表達而下調Bax、cleaved-caspased-3蛋白表達，進而抑制高糖誘導的細胞凋亡。

圖3 miR-96-5p過表達對高糖誘導的RRVEC凋亡的影響

圖4 抑制FOXO4表達對高糖誘導的RRVEC增殖和凋亡的影響

2.5 miR-96-5p靶向調控FOXO4的表達雙熒光素酶報告實驗顯示(圖5A、5B)，RRVEC中miR-96-5p mimic能夠顯著抑制WT-FOXO4報告載體的熒光素酶活性(t=17.192，P<0.05)，miR-96-5p與FOXO4結合位點突變后，miR-96-5p mimic對MUT-FOXO4報告基因載體的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，表明miR-96-5p能夠直接靶向RRVEC中FOXO4的3’UTR進而抑制其表達。進一步采用Western blotting法檢測miR-96-5p過表達或抑制miR-96-5p表達后FOXO4蛋白表達變化，結果顯示(圖5C、5D)，與miR-NC組相比，轉染miR-96-5p mimic的RRVEC中FOXO4蛋白表達水平受到明顯抑制(t=13.800，P<0.05)，而轉染anti-miR-96-5p的RRVEC中FOXO4蛋白表達水平較anti-miR-NC組明顯升高(t=18.120，P<0.05)，表明miR-96-5p可直接靶向調節FOXO4表達水平。

圖5 miR-96-5p靶向調控FOXO4的表達

2.6 FOXO4過表達逆轉miR-96-5p過表達對高糖誘導的RRVEC增殖和凋亡的作用轉染miR-96-5p mimic后再轉染pcDNA-FOXO4以此驗證miR-96-5p過表達是否通過抑制FOXO4表達進而促進高糖誘導的RRVEC增殖并抑制細胞凋亡。Western blotting檢測結果顯示(圖6A、6B)，轉染miR-96-5p mimic后再采用pcDNA-FOXO4轉染高糖誘導的RRVEC(HG+miR-96-5p+pcDNA-FOXO4組)，細胞中FOXO4表達水平顯著高于HG+miR-96-5p+pcDNA組(t=15.949，P<0.05)，表明細胞轉染成功。進一步檢測RRVEC增殖及凋亡變化情況，結果顯示，與HG+miR-96-5p+pcDNA組比較，HG+miR-96-5p+pcDNA-FOXO4組細胞增殖活性明顯降低(t=9.675，P<0.05，圖6C)，細胞凋亡率明顯增加(t=8.937，P<0.05，圖6D)，p21、Bax蛋白表達升高(t=11.833、8.737，均P<0.05，圖6E、6F)，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達降低(t=9.985、7.904，均P<0.05，圖6E、6F)，表明FOXO4過表達可逆轉miR-96-5p過表達對高糖誘導的細胞增殖和凋亡的作用。

圖6 FOXO4過表達逆轉miR-96-5p過表達對高糖誘導的RRVEC增殖和凋亡的作用

3討論

糖尿病視網膜病變發生后血管內皮細胞會暴露在血漿中并極易受到高血糖刺激而發生損傷，隨后破壞視網膜屏障，高糖持續刺激情況下可抑制視網膜血管內皮細胞增殖，還可能通過促進細胞凋亡進而促使內皮細胞損傷[10-11]。研究表明，miRNA表達異常可通過調節相關信號通路進而影響糖尿病視網膜病變大鼠視網膜血管內皮細胞增殖與凋亡[12]。目前關于miRNA與糖尿病視網膜病變發生機制的研究相對較少，因此積極尋找新型miRNA與糖尿病視網膜病變發生及發展的關系對臨床預防及治療均具有重要意義。

研究發現，miR-96-5p表達異常可能參與人類滋養層細胞的自噬和遷移損傷過程[13]。長非編碼RNA CASC2通過調節miR-96-5p/SYVN1途徑進而抑制乳腺癌細胞生長和轉移[14]。miR-96-5p通過靶向caspase-9基因進而調控肝癌細胞凋亡[15]。本研究結果顯示，高糖處理后RRVEC中miR-96-5p表達水平顯著降低，高糖誘導的RRVEC轉染miR-96-5p mimic而上調其表達水平，結果發現高糖誘導后細胞增殖能力明顯降低，而轉染miR-96-5p mimic后細胞增殖能力明顯增強，進一步研究顯示，轉染miR-96-5p mimic后高糖誘導的RRVEC中CyclinD1蛋白表達水平顯著增高，而p21、p27蛋白表達水平顯著降低。另有研究表明，CyclinD1可正向調控細胞周期，p21、p27可負向調控細胞周期，p21、p27表達水平升高可抑制CyclinD1對細胞周期的調控作用[16-17]。說明上調miR-96-5p表達可通過上調CyclinD1的表達及下調p21、p27的表達進而促進RRVEC增殖。同時本研究結果發現，高糖誘導后RRVEC凋亡率明顯增加，miR-96-5p過表達可降低細胞凋亡率，通過檢測細胞凋亡蛋白表達，結果發現，miR-96-5p過表達Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，而Bax蛋白表達水平明顯降低。相關研究結果表明，通過抑制高糖誘導的血管內皮細胞中Bax、cleaved-caspased-3的表達，增強Bcl-2的表達能夠抑制血管內皮細胞凋亡，最終達到治療糖尿病血管病變的目的[18]。說明上調高糖誘導的RRVEC中miR-96-5p表達可通過促進Bcl-2表達及抑制Bax、cleaved-caspased-3表達，進而抑制細胞凋亡。提示miR-96-5p過表達可通過影響細胞增殖及凋亡蛋白表達進而影響高糖誘導的細胞增殖及凋亡，由此推測miR-96-5p上調表達可能作為臨床早期診斷及防治糖尿病視網膜病變的重要分子標志物。

FOXO4可能通過調控胰島素等參與糖尿病并發癥的發生及發展過程[19-20]。糖尿病條件下沉默FOXO4表達可保護內皮細胞，并可參與內皮組織損傷等過程，同時胰島素及靶器官中營養物質等均可影響FOXO4表達[21]。相關研究表明，糖尿病視網膜病變組織中FOXO4表達水平明顯升高并可能調控血管內皮細胞損傷發生過程[22]。本研究結果顯示，高糖誘導后RRVEC中FOXO4表達水平明顯升高，通過轉染si-FOXO4后發現RRVEC增殖活性明顯增強，細胞凋亡率明顯下降，促進CyclinD1、Bcl-2的表達，抑制p21、Bax的表達，說明抑制FOXO4表達可通過上調CyclinD1、Bcl-2的表達及下調p21、Bax的表達進而促進高糖誘導的細胞增殖并抑制細胞凋亡。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證FOXO4是miR-96-5p的靶基因，miR-96-5p可負向調控FOXO4表達。為驗證miR-96-5p是否通過抑制FOXO4表達進而對高糖誘導的RRVEC增殖及凋亡產生影響，結果發現高糖誘導的RRVEC共轉染miR-96-5p mimic與pcDNA-FOXO4后細胞增殖活性明顯降低，細胞凋亡率明顯增加，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，而p21、Bax蛋白表達水平明顯升高，說明miR-96-5p過表達可通過下調FOXO4表達進而促進高糖誘導的細胞增殖并抑制細胞凋亡。提示miR-96-5p過表達能夠抑制高糖誘導的RRVEC凋亡并促進細胞增殖。

綜上所述，miR-96-5p在高糖誘導的RRVEC中呈低表達，FOXO4表達水平升高，上調miR-96-5p表達可促進高糖誘導的細胞增殖以及抑制細胞凋亡的發生，其作用機制可能是通過抑制靶基因FOXO4表達，上調下游CyclinD1、Bcl-2表達，下調p21、p27、Bax、cleaved-caspased-3表達，提示上調miR-96-5p表達可通過抑制FOXO4表達進而影響細胞增殖及凋亡蛋白表達而保護視網膜血管內皮細胞，可為臨床防治糖尿病視網膜病變提供理論依據。但關于miR-96-5p表達變化及其對下游相關信號通路的影響均需進行分子生物學研究證實。