維生素D受體基因多態(tài)性與2型糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的相關性分析

嚴 凱，劉 意，田慧麗

0引言

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是臨床最常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，DR是成人致盲的重要原因，據(jù)相關報道，超過一半的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者會患視網(wǎng)膜病變，其中近1/3的患者會因DR而失明[1]。可見，DR嚴重威脅T2DM患者的生活質量，同時給患者家庭和社會帶來沉重的負擔。2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的具體發(fā)病機制仍未闡明，目前維生素D與T2DR的相關性是國內(nèi)外研究的熱點[2]。維生素D是一組內(nèi)分泌激素，在肝臟及腎臟內(nèi)羥化成為活性1，25-二羥基維生素D3[1,25(OH)2D3]，具有抗氧化、抑制血管平滑肌增生以及抗血管增殖的作用，在視網(wǎng)膜組織中廣泛表達[3]。維生素D與維生素D受體(VDR)結合，通過激活及調節(jié)多條細胞通路來發(fā)揮其生物學作用[4]。近年來，出現(xiàn)少數(shù)關于VDR基因多態(tài)性與DR相關性的相關報道，但結果差異較大甚至截然相反。因此，本研究通過多重高溫連接酶檢測反應(improved multiple ligase detection reaction，iMLDR)技術進行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型，檢測并分析DR患者rs1544410、rs2228570的VDR SNPs位點基因多態(tài)性，旨在探討VDR基因多態(tài)性與DR的相關性，為DR的臨床預防及個性化治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1對象和方法

1.1對象篩選2018-02/2019-01我院收治的T2DM患者作為研究對象。納入標準：(1)符合《中國2型糖尿病防治指南(2017版)》[5]相關診斷標準；(2)同意取血樣行DNA檢測；(3)個人資料完整；(4)患者自愿參與本研究，并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)與已納入對象有血緣關系；(3)腎功能衰退；(4)急性或者慢性炎癥者；(5)其他原因導致的視網(wǎng)膜病變。最終納入研究的T2DM患者共198例。本研究遵循《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》，并經(jīng)我院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1分組方法采用免散瞳數(shù)碼眼底成像方法對198例患者進行眼底檢查。患者先在暗室內(nèi)適應視覺，后由眼科醫(yī)師使用佳能EOS 40D免散瞳數(shù)碼眼底相機獲取45°后極部視網(wǎng)膜彩色圖像。由眼科醫(yī)師根據(jù)美國眼科協(xié)會出臺的2018年糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床指南[6]閱片診斷，并將198例患者分為DR組(n=108)和非DR組(n=90)。

1.2.2檢測方法

1.2.2.1相關指標檢測使用EDTA管取患者入院次日清晨空腹靜脈血約5mL，提取DNA，-80℃儲存?zhèn)溆谩z測空腹血糖(FBG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。

1.2.2.2 PCR擴增主要試劑：Taq DNA聚合酶(賽默飛世爾科技有限公司，中國)，引物(上海生工生物工程公司)，PCR反應緩沖液(TaKaRa公司)，PCR Marker(南京賽泓瑞生物科技有限公司)，瓊脂糖(上海源葉生物科技有限公司)等。PCR條件：反應體系10μL包括1×HotStarTap緩沖液、0.30mmol/L dNTP、3.0mmol/L Mg2+、1U HotStarTap聚合酶、1μL DNA樣本及1μL多重PCR引物，引物序列見表1。反應熱循環(huán)：95℃預變120s；94℃ 20s、65℃ 40s、72℃ 90s，循環(huán)11次；94℃ 20s、59℃ 30s、72℃ 90s，循環(huán)24次；72℃延伸120s，4℃保存。

表1 各SNP的引物序列

1.2.2.3 PCR產(chǎn)物純化5U SAP酶、2U Exonuclease Ⅰ酶加入10μL PCR產(chǎn)物中，溫浴(37℃，60min)，然后滅活(75℃，15min)。連接引物反應體系：10×連接緩沖液(1.0μL)、0.25μL高溫連接酶、0.4μL 5’連接引物混合液(1.0μmol/L)，0.4μL 3’連接引物混合液(2.0μmol/L)、2.0μL純化后多重PCR產(chǎn)物、6.0μL ddH2O，混勻。將稀釋后的連接產(chǎn)物(0.5μL)、Liz 500SIZ STANDARD(0.5μL)、hi-Di(9.0μL)混勻，變性(95℃，5min)后上ABI 3730XL基因測序儀，所得原始數(shù)據(jù)應用GemeMap-per4.1(ABI)進行分析。

2結果

2.1兩組一般資料比較兩組患者年齡、性別、T2DM病程、體質量指數(shù)及HDL-C比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；DR組的HbA1c、FBG、LDL-C、TG、VEGF顯著高于非DR組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 VDR基因位點Hardy-Weinberg平衡檢驗rs1544410、rs2228570位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，提示2個位點選擇的樣本具有群體代表性，見表3。

表3 兩組VDR基因位點Hardy-Weinberg平衡檢驗 例

2.3非DR組與DR組VDR基因位點的基因型和等位基因頻率分布比較DR組VDR基因rs1544410位點T等位基因頻率、rs2228570位點A等位基因頻率均顯著高于非DR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 非DR組與DR組VDR基因位點的基因型和等位基因頻率分布比較 例(%)

2.4 VDR基因BsmI基因型間相關指標比較CC基因型130例，CT基因型52例，TT基因型16例。CC基因型與CT+TT基因型相關指標比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 VDR基因BsmI基因型間相關指標比較

2.5 VDR基因FokI基因型間相關指標比較GG基因型121例，GA基因型59例，AA基因型18例。GG基因型與GA+AA基因型相關指標比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表6。

表6 VDR基因FokI基因型間相關指標比較

變量BWaldPOR95%CIBsmI基因CT+TT基因型0.9517.7800.0242.5881.108～6.450FokI基因GA+AA基因型0.6885.5050.0381.9901.404～8.220

2.6 Logistic回歸分析rs1544410、rs2228570與2型糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的關系以是否發(fā)生DR作為因變量(1代表發(fā)生，0代表不發(fā)生)，選擇以上比較有統(tǒng)計學意義的因素(HbA1c、FBG、LDL-C、TG、VEGF)及BsmI基因顯性模型、FokI基因顯性模型作為自變量，進行非條件Logistic回歸分析，結果顯示BsmI基因CT+TT基因型、FokI基因GA+AA基因型是DR的危險因素(P<0.05，表7)。

3討論

目前，DR發(fā)生普遍被認為與患者的高血糖有關，高血糖會促使白細胞對微血管上皮細胞的黏附，引起細胞損傷、血液流變學變化，導致視網(wǎng)膜破壞[7]。有研究顯示，血清維生素D水平不足或缺乏會增加胰島素抵抗作用、降低胰島β細胞功能[8-9]。許多研究證實，T2DM患者血清25(OH)D與HbA1c、FPG呈負相關,25(OH)D水平下降可能是T2DM發(fā)生的機制之一，且25(OH)D水平下降可增加T2DM合并周圍血管病變的風險[10-11]。李俊等[12]的研究闡述了T2DR的發(fā)生與患者血清維生素D的關系，發(fā)現(xiàn)25(OH)D水平與T2DR的發(fā)生呈負相關，認為維生素D在DR的發(fā)病過程中對視網(wǎng)膜具有保護的作用，而維生素D缺乏則會增加DR發(fā)生風險。關于維生素D對DR的發(fā)病機制不明確，可能為血清25-OH-VD3抑制視網(wǎng)膜組織中的VEGF和轉化生長因子-1(TGF-1)的表達，減少因VEGF的過度表達導致的血管內(nèi)皮細胞凋亡，VEGF的升高可增強血糖對神經(jīng)元的毒性，加重微血管并發(fā)癥，加速對玻璃體的侵襲，促進DR的發(fā)生發(fā)展[13-14]。

1,25(OH)2D3是維生素D3的主要活性形式，與VDR結合在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學效應，近幾年VDR與DR的相關性已成為國內(nèi)外研究的熱點，其中維生素D與VDR結合，通過激活及調節(jié)多條細胞通路來發(fā)揮其生物學作用，因此，有學者認為VDR基因在DR發(fā)病過程中起到?jīng)Q定性作用[15]。VDR是DR候選基因之一，屬于親核蛋白，具有單核苷酸多態(tài)性。Zhong等[16]發(fā)現(xiàn)DR發(fā)病率與患者VDR rs2228570位點基因多態(tài)性顯著相關，認為VDR的rs2228570基因位點可作為T2DR的良好生物標志物。Hong等發(fā)現(xiàn)韓國人VDR基因中的BsmI多態(tài)性可作為預測T2DM并發(fā)癥發(fā)生的易感性標記物[17]。侯麗君等[18]研究結果顯示，中國山東泰安及周邊地區(qū)漢族人VDR基因FokI多態(tài)性與T2DR發(fā)病顯著相關。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，非DR組BsmI等位基因頻率T 11.1%，C 88.9%，DR組BsmI等位基因頻率T 29.6%，C 70.4%；非DR組FokI等位基因頻率A 15.0%，G 85.0%，DR組FokI等位基因頻率A 31.5%，G 68.5%；DR組VDR基因rs1544410位點T等位基因頻率、rs2228570位點A等位基因頻率均顯著高于非DR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，本研究分析了VDR基因BsmI、FokI基因型間DR相關生化指標的比較，發(fā)現(xiàn)BsmI、FokI的不同基因型之間的FBG、LDL-C、TG、HbA1c和VEGF水平差異明顯(P<0.05)，進一步Logistic分析中顯示BsmI基因CT+TT基因型、FokI基因GA+AA基因型是DR的危險因素(P<0.05)。這些提示VDR基因BsmI、FokI多態(tài)性與DR顯著相關。本研究與上述研究結果相似，但其中相關機制尚不明確，考慮可能VDR BsmI和FokI多態(tài)性導致VDR無法介導1,25(OH)2D3發(fā)揮生物學效應，無法有效發(fā)揮抑制視網(wǎng)膜血管增生的作用，有待進一步機制研究。但是，在李麗等[19]的研究中，VDR基因BsmI、FokI多態(tài)性與新疆漢族T2DR并無明顯相關性，與本研究及其他研究結果差異較大，考慮原因可能是VDR基因多態(tài)性具有區(qū)域及種族分布差異性，與人的生活習慣及地理環(huán)境有關，或與研究的納入標準、排除標準及試驗方法的不同有關。因此，仍需更大樣本量更深入的研究予以進一步證實。

綜上所述，VDR基因BsmI、FokI多態(tài)性與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變顯著相關，但其機制尚未明確，可能是2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的易感基因位點。