液相色譜串聯質譜法測定牛奶中黃曲霉毒素M1不確定度分析

□ 王玉梅 劉 真 孫小杰 南京市食品藥品監督檢驗院

黃曲霉毒素M1（A FM1）是含有二呋喃環的氧雜萘鄰酮，是由黃曲霉毒素B1羥基化衍生而來[1]。AFM1對酸、光及熱都很穩定，主要存在于動物的可食部分，比如蛋類、牛奶、肝臟等，其中以牛奶最為常見，目前已經成為乳制品質量安全風險評估的主要危害因素[2]。AFM1是目前發現的致癌性較強的毒素之一，它能夠很大程度上破壞人及動物的肝臟組織，對人體產生肝腎等毒性，也存在致畸、致癌、致突變等風險，嚴重時會導致死亡[3]。本文參照JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》[4]、JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[5]，JJG 646—2006《移液器檢定規程》[6]和JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》[7]，依據GB 5009.24—2016《食 品 安全國 家標準 食品中黃曲霉毒素M 族的測定》（第一法 同位素稀釋液相色譜—串聯質譜法）[8]分析了牛奶中黃曲霉毒素M1含量檢測的不確定度，以期為實驗室質量控制提供有力的依據，同時也為其他真菌毒素類物質測定的不確定度分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6470 串聯四極桿液相色譜質譜儀（配制ESI 源）；ME503T 電子天平（d=0.001 g）；黃曲霉毒素M1標準品（10.0 μg/mL，純度≥99%，阿 爾 塔）；13C17—黃 曲 霉M1標 準品（BZYX483）（0.507 μg/mL，純 度≥99.9%，ROMER）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

準確移取黃曲霉毒素M11.00 mL于10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 μg/mL 的標準儲備溶液。準確移取標準儲備溶液1.00 mL 至10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得到100.0 ng/mL 的標準工作液。準確移取13C17—黃曲霉毒素M11.00 mL，用乙腈定容至10 mL，配制成50.7 ng/mL的同位素內標工作液。

將標準儲備液逐級稀釋，得到質量濃度為0.5、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL 與25.00 ng/mL 的 黃 曲霉毒素M1標準工作液，其中內標的質量濃度為0.507 ng/mL，供高效液相色譜—質譜聯用儀測定。

1.2.2 樣品前處理

按 照GB 5009.24—2016[8]標 準 方法，稱取4 g 混合均勻的試樣（精確至0.001 g）于50 mL 離心管中，加入10 μL13C17—AFM1內標溶液（50.7 ng/mL）振蕩混勻后靜置30 min，加入10 mL 甲醇，渦旋3 min。置于4℃、5000 r/min下離心10 min，經玻璃纖維濾紙，將適量濾液轉移至燒杯中，加40 mL水；將恢復至室溫的免疫親和柱內的液體棄掉，將上述樣液移至50 mL注射器筒中，控制下滴流速為1 ～3 mL/min。待樣液滴完后，往注射器筒內加入10 mL 水，并抽干親和柱，加入2×2 mL 乙腈（或甲醇）洗脫親和柱，收集全部洗脫液。在50 ℃下氮吹至近干，用初始流動相定容至1.0 mL溶解殘留物，0.22 μm 濾膜過濾，待測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD，粒度1.8μm，50×2.1mm（內徑）；流速：0.3mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：1μL；流動相：A—乙腈；B—0.1%甲酸/水，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.2.4 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）；正離子方式檢測，檢測方式為多離子反應監測（MRM）；定量分析的離子對為：黃曲霉毒素M1母離子m/z 329.0，定量子離子m/z 272.7，定性子離子m/z 258.7；13C17—黃曲霉毒素M1母離子m/z 346.0，定量子離子m/z 287.9，定性子離子m/z 242.0。

1.2.5 數學模型的建立

被測物殘留量X計算方法見式（1）。

式（1）中：X ─試樣中黃曲霉毒素M1的含量，μg/kg；C ─儀器檢出目標物含量，ng/mL；V ─溶解試樣或濃縮后所定容的體積，V=1.00 mL；m ─試樣質量，g；K ─凈化過程取樣體積換算系數，K=1。

2 結果與分析

2.1 不確定度分量的來源分析

根據上述方法對樣品進行分析時，測量的不確定度的主要有以下幾個方面：①儀器檢出目標物含量引入的不確定度。包含標準品純度引入的不確定度，標準品稱量、標準溶液稀釋過程引入的不確定度，標準曲線擬合產生的不確定度。②樣品前處理過程引入的不確定度。包括樣品的稱量、添加內標溶液、量取溶液體積以及加標回收率引入的不確定度。③樣品重復測定引入的不確定度。

2.2 不確定度的評定

2.2.1 儀器檢出目標物含量引入的不確定度Urel（1）

儀器檢出目標物含量的不確定度主要由標準品純度、標準系列溶液配置帶來的不確定度。標準系列溶液配制又分為儲備液的配制、儲備液的稀釋以及標準曲線溶液的配制。

（1）標準品純度引入的相對標準不確定度Urel（1—1）

根據標準品證書提供的信息，黃曲霉毒素M1純度不小于99%，按照矩形分布，由標準品純度引入的相對標準不確定度為：

內標物純度≥99.9%，內標對于標準品和樣品的影響可相互抵消，因此由內標物純度引起的不確定度不予考慮。

（2）標準系列溶液配置過程產生的不確定度Urel（1—2）

儲備液配置及工作液稀釋過程產生的不確定度Urel（p）：準確移取黃曲霉毒素M11.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 μg/mL的標準儲備溶液。準確移取標準儲備溶液1.00 mL 至10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得到100.0 ng/mL的標準工作液。

在標準溶液配置及工作液稀釋過程中，使用10 mL 容量瓶2 次，1 mL移液管2 次，按照JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》的要求進行計算。

A 級 單 標 線1 mL（V1）移 液 管最大允許誤差為：±0.007 mL，取矩形分布，其相對標準不確定度實驗室溫度為（20±5）℃，有機溶劑 體 積 膨 脹 系 數 為1.1×10—3/℃，1 mL 移液管由溫度引起的體積不確定 度 為0.003175 mL，兩者合成得到的相對標準不確定度為：

A 級單線10 mL（V2）容量瓶，最大允許誤差為：±0.020 mL。取矩形分布，其相對標準不確定度為：0.01155 mL；10 mL 容量瓶由溫度引起的體積不確定度為兩者合成得到的相對標準不確定度為：

由此合成標準溶液配置及工作液稀釋過程中引入的相對標準不確定度為：

標準工作液稀釋過程引入的相對標準不確定度Urel（x）：標準工作液配置過程為分別精密移取5、20、50、100、200 μL 與250 μL 標準工作液至1 mL 容量瓶中，用初始流動相定容至刻度，得濃度為0.5、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL 與25.00 ng/mL的標準系列溶液。移液器刻度誤差參考JJG 646—2006《移液器檢定規程》的要求，按照均勻分布處理，標準工作液配制過程引入的相對標準不確定度見表2。

表2 標準工作液配制過程引入的相對標準不確定度

則由標準工作液配制過程引入的 相對標準不確定度為：

綜上，標準系列溶液配置過程 中由各分量合成的相對標準不確定度為：

綜上，由儀器檢出目標物含量引入的相對不確定度為：

2.2.2 樣品前處理過程引入的不確定度Urel（2）

（1）樣品稱量引入的不確定度Urel（2—1）

電子天平校準的最大允許誤差為±0.001 g，稱取食用油樣品4 g，按矩形分布，引入的相對標準不確定度為：

（2）添加內標溶液引入的不確定度Urel（2—2）

準確移取13C17—黃曲霉毒素M1儲備液1.00 mL，用乙腈定容至10 mL，配制成5.07 ng/mL 的同位素內標工作液。采用200 μL 移液器準確量取5.07 ng/mL的13C17—黃曲霉毒素M1標準工作液100 μL，按 照JJG 646—2006《移 液 器檢定規程》的要求，10 μL 移液器移取10 μL 時允許誤差為±2.0%，取矩形分布，由移液器引入的不確定度為：

（3）量取溶液體積引入的不確定度Urel（2—3）

量取體積產生的不確定度主要是最終定容體積引入的不確定度。A 級1 mL單標線吸管最大允許誤差為：±0.007 mL，取矩形分布，相對標準不確定度為：

（4）加標回收率引入的不確定度Urel（2—4）

對樣品進行8 次加標回收實驗，添加水平為6.25 μg/kg，回收率分別f 為101.2%、98.7%、96.5%、101.8%、103.0%與99.5%（見表3），平均回收率ˉf 為99.3%，標準偏差為2.58%，由加標回收率引入的相對標準不確定度為：

綜上，在樣品前處理過程中，各分量合成的相對標準不確定度為：

對被測樣品溶液測量2 次，由回歸方程計算得到樣品中的黃曲霉毒素M 1 最佳估計值（Co），見表4。

2.2.3 樣品重復測定引入的不確定度Urel（3）

對同一樣品進行前處理和測定，重復8 次，計算得到樣品中黃曲霉毒素M1含量分別為6.0092、6.0642、6.0313、5.9624、5.9770、6.0485、5.9953 μg/kg 與5.9776 μg/kg。平均值為6.0082 μg/kg，標準偏差為0.0377 μg/kg。由樣品重復測定引入的相對標準不確定度為：

3 測量不確定度的評定與報告

3.1 合成相對標準不確定度

由上述計算得到的各不確定度分量的數據合成相對標準不確定度為：

3.2 擴展不確定度

依 據JJF 1135—2005《化 學 分析測量不確定度評定》，在95.45%的置信水平下，取包含因子k=2，牛奶中黃曲霉M1的測量平均值為4.7342 ng/mL，結合稱樣量m 和定容體積V，計算得到樣品中黃曲霉毒素M1的含量為1.1815 μg/kg，則擴展不確定度為：U=1.1815×0.02170×2=0.05128 μg/kg。

3.3 測定結果

按照該方法測定牛奶中黃曲霉毒 素M1的 含 量 為：X=（1.1815±0.05128）μg/kg；k=2。

4 結論

通過本次測定的不確定度評定的過程可以看出，使用GB 5009.24—2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素M 族的測定》（第一法）定量分析牛奶中黃曲霉毒素M1含量時，其擴展不確定度為（1.1815±0.05128）g/kg，k=2，其中標準溶液及其工作液的制備對最終結果產生的影響最大，所以在實際檢驗工作中，需要提高檢驗人員在標準溶液配置方面的操作技能來提高結果的準確性。