納洛酮對蛛網膜下腔出血大鼠海馬區神經細胞自噬的影響

李小亮，李君，李林，孫林林，陳揚，付愛軍

作者單位：1華北理工大學附屬醫院神經外科，河北 唐山063000；2開灤總醫院林西醫院神經外科，河北 唐山063000；3鄭州市第七人民醫院神經外科，河南 鄭州450000

自發性蛛網膜下腔出血（SAH）是嚴重威脅人類健康的一種疾病，由于其發病突然、變化迅猛，給救治帶來很大的挑戰，絕大多數SAH為動脈瘤破裂所致［1］，據不完全統計SAH發病率約為每年10.5∕10萬人口［2］，并且呈逐年上升趨勢。隨著顯微腦血管外科、高分辨率影像后處理技術、麻醉理論及血管內介入水平的不斷發展及提高，其病死率較前有所下降，但致殘率一直處于較高水平［3］，治療后大概33%的SAH病人遺留嚴重的神經功能缺失并需長期護理［4］，給病人和家庭帶來沉重的經濟負擔以及身心上的雙重創傷［5］。既往的學者認為，導致SAH病人神經功能缺失的主要因素為腦血管痙攣（CVS）［6］，但是應用藥物拮抗CVS的發生后，并未顯著改善SAH病人的神經功能缺失。近年來文獻報道，應用藥物或其它措施對SAH早期腦損傷的盡早干預，可以減輕神經功能缺失［7］。目前對SAH早期腦損傷的機制研究中，自噬被廣泛關注，適當活化的自噬可以減輕大鼠SAH模型早期腦損傷的損害性發展，從而保護神經功能［8］。納洛酮注射液是阿片類受體阻滯劑，在臨床上普遍使用，并取得了不錯的療效。有研究報道納洛酮注射液在治療SAH所致的腦損傷方面具有積極的意義［9］，但相關機制尚不明確。

本研究于2016年10月至2018年10月采取刺破頸內動脈的方法制作SAH大鼠模型，觀察納洛酮注射液對大鼠行為學功能及自噬相關蛋白Beclin-1及微管相關蛋白1輕鏈3（LC3-Ⅱ）的影響，探討納洛酮注射液對SAH的可能作用機制，為臨床治療提供豐富的基礎醫學支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物 108只健康雄性清潔級SD大鼠，周齡范圍為9～12周，體質量（350±30）g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號SCXK（京）2014-0004。飼養于華北理工大學動物實驗中心動物飼養室，正常通風光照，維持室溫于（23±2）℃，濕度控制于（50±15）%，自由活動并正常飲水進食，避免不良刺激。在實驗開始前1周進行環境適應。采用隨機數字表法將108只大鼠分為三組，依次為假手術組、SAH組、納洛酮組，每組36只，并相應做好標記，每組再依次分為6 h、24 h、72 h三個亞組，每個亞組12只。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2 藥物和試劑 納洛酮注射液（1 mL∶0.4 mg）；Beclin-1（ABclonal生物技術有限公司）和LC3-Ⅱ抗體（GeneTex生物技術有限公司）；內參微管蛋白（tubulin）（美國Abcam公司）；二抗及顯色用品（美國KPL公司）。

1.1.3 主要儀器 820-Ⅱ型切片機（德國Leica公司）；OLYMPUS攝像顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；凝膠成像分析系統；圖像采集及分析系統。

1.2方法

1.2.1 模型建立 根據文獻采用頸動脈刺破法制作SAH大鼠模型［10］：腹腔內注射10%水合氯醛（300 mg∕kg）麻醉大鼠，刺激無反應后將其仰臥并固定，頸部術前無菌處理，縱行剪開，沿組織間隙進行分離，暴露并解剖頸總動脈及頸內外動脈，遠心端扎閉并剪斷頸外動脈，牽拉使其與頸內動脈進入顱內的方向一致，將銳化并標記好的纖芯自遠心端穿入頸外動脈并沿頸內動脈直至顱內，刺破血管，造成SAH模型。然后將傷口消毒后縫合，正常飼養。以取腦時環池、基底池有血凝塊為模型制備成功的標準。假手術組只將纖芯沿血管穿入顱內，避免刺穿血管，其它操作步驟與SAH組相同。

1.2.2 給藥方法 納洛酮組刺破顱內血管后立即給予腹腔內注射納洛酮注射液（1 mg∕kg），每12小時1次，用藥至處死的各時相點。假手術組和SAH組采用同樣方法給予同等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.3 穿梭箱實驗 各組實驗大鼠于造模前2 d開始進行訓練，每天練習2次，以培養條件反射。術后于預設時間，首先在穿梭箱內讓實驗大鼠進行環境適應5 min，達到去除條件反射的目的，然后給予5 s聲光刺激，再給予20 s電刺激（電擊強度30 V，50 Hz）。觀察大鼠的逃避情況，每間隔20 s訓練1次，共計30次。視頻分析實驗大鼠的逃避情況。統計逃避次數及逃避反應時間（大鼠受到刺激至逃到安全區的平均次數與時間）。

1.2.4 蘇木精-伊紅（HE）染色于造模成功后的各個時間點，采取腹腔內注射10%水合氯醛（300 mg∕kg）將大鼠深度麻醉，待其無反應后進行左心室穿刺灌注，先灌注0.9%氯化鈉溶液500 mL、再灌注4%多聚甲醛250 mL，在冰上解剖取出腦組織，并置于4%多聚甲醛中固定3 d。對固定好的腦組織進行常規石蠟包埋，層厚5μm做連續冠狀位切片（包含海馬組織），每只大鼠腦標本蠟塊取3張進行HE染色。光學顯微鏡（×400）觀察海馬CA1區神經細胞形態及結構，按隨機數字表法保存6個不同視野的照片，并用Motic-6.0分析系統統計結構無異常的神經細胞數量。

1.2.5 免疫組織化學染色 每只大鼠腦標本蠟塊取6張切片，進行常規脫蠟、水化、高壓修復、室溫孵育。按隨機數字表法等分成2組，一組滴加Beclin-1抗體（1∶100），另一組滴加LC3-Ⅱ抗體（1∶100），將滴加抗體的切片放入4℃冰箱過夜（超過12 h），滴加組化二抗，孵育、脫水、透明、顯色、封固。光學顯微鏡（×400）觀察海馬CA1區神經細胞，按隨機數字表法保存6個不同視野的照片，并用Motic-6.0分析系統統計陽性細胞數量。

1.3統計學方法使用Excel 2007收集計量資料，所得數據以xˉ±s表示，使用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，采用LSD-t檢驗進行多組間的兩兩比較。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1穿梭箱實驗與假手術組對比，SAH組6 h、24 h、72 h大鼠躲到安全區的次數均減少，躲到安全區的時間均延長（P＜0.05）；與SAH組對比，納洛酮組6 h、24 h、72 h躲到安全區的次數均增多，躲到安全區的時間均縮短（P＜0.05）。見表1，2。

表1各組大鼠各時間點逃避反應次數比較∕（次±s）

表1各組大鼠各時間點逃避反應次數比較∕（次±s）

注：與假手術組比較，a P＜0.05；與SAH組比較，b P＜0.05，SAH為蛛網膜下腔出血

組別假手術組SAH組納洛酮組F值P值鼠數36 36 36 6 h 24.83±3.24 14.41±1.98a 16.50±1.93b 60.282 0.000 24 h 25.33±2.64 16.25±2.18a 19.25±2.30b 45.317 0.000 72 h 25.16±2.82 18.33±2.57a 22.50±2.20b 22.017 0.000

表2各組大鼠各時間點逃避反應時間比較

表2各組大鼠各時間點逃避反應時間比較

注：與假手術組比較，a P＜0.05；與SAH組比較，b P＜0.05，SAH為蛛網膜下腔出血

組別假手術組SAH組納洛酮組F值P值鼠數36 36 36 6 h 3.54±0.99 9.09±1.38a 8.05±1.24b 70.948 0.000 24 h 3.55±0.84 8.73±1.13a 6.56±1.09b 76.479 0.000 72 h 3.54±0.83 8.00±1.04a 5.36±0.97b 66.653 0.000

2.2 HE染色假手術組6 h、24 h、72 h海馬CA1區神經細胞絕大部分形態正常，細胞質均一，細胞核結構完整，染色適中。SAH組海馬CA1區神經細胞情況：6 h亞組鏡下顯示少量細胞的細胞核染色加深、梭形固縮；24 h亞組細胞核深染、梭形固縮情況明顯增多，并出現核破碎；72 h亞組細胞核深染、梭形固縮、核破碎情況進一步加劇。納洛酮組對比SAH組，6 h、24 h、72 h細胞核深染、梭形固縮、核破碎等情況均相對減少。見表3。

2.3免疫組織化學染色選取自噬的特異性標志物Beclin-1和LC3-Ⅱ，經染色及顯色后，胞質中出現棕黃、黃褐色顆粒樣物質既表明該細胞發生了自噬。假手術組各個時間點可見少數細胞陽性表達。SAH組：6 h亞組胞質中出現棕黃、黃褐色顆粒樣物質的細胞數較假手術組增多；24 h亞組細胞質中出現棕黃、黃褐色顆粒樣物質的細胞數明顯增多；72 h亞組細胞質中出現棕黃、黃褐色顆粒樣物質的細胞數仍很多。納洛酮組各個時間點細胞質中出現棕黃、黃褐色顆粒樣物質的細胞數均比SAH組各個時間點增多。見表4，5。

表3 各組各時間點大鼠海馬區結構無異常的神經細胞數量∕個，（±s）

表3 各組各時間點大鼠海馬區結構無異常的神經細胞數量∕個，（±s）

注：與假手術組比較，a P＜0.05；與SAH組比較，b P＜0.05，SAH為蛛網膜下腔出血

組別假手術組SAH組納洛酮組F值P值鼠數36 36 36 6 h 122.67±5.55 84.25±12.63a 94.75±11.06b 45.394 0.000 24 h 122.25±5.50 75.58±11.11a 84.50±9.21b 92.685 0.000 72 h 121.58±5.68 67.75±10.55a 77.33±9.88b 126.258 0.000

表4 各組各時間點大鼠海馬區Beclin-1蛋白陽性細胞數量∕（個，ˉ±s）

表4 各組各時間點大鼠海馬區Beclin-1蛋白陽性細胞數量∕（個，ˉ±s）

注：與假手術組比較，a P＜0.05；與SAH組比較，b P＜0.05，SAH為蛛網膜下腔出血

組別假手術組SAH組納洛酮組F值P值鼠數36 36 36 6 h 20.50±3.45 31.41±4.96a 36.17±4.06b 43.788 0.000 24 h 20.33±2.77 47.67±7.35a 57.58±6.68b 125.938 0.000 72 h 20.50±3.59 43.17±6.46a 52.75±7.35b 92.324 0.000

表5 各組各時間點大鼠海馬區LC3-II蛋白陽性細胞數量∕（個ˉ±s）

表5 各組各時間點大鼠海馬區LC3-II蛋白陽性細胞數量∕（個ˉ±s）

注：與假手術組比較，a P＜0.05；與SAH組比較，b P＜0.05，SAH為蛛網膜下腔出血

組別假手術組SAH組納洛酮組F值P值鼠數36 36 36 6 h 17.08±3.00 27.42±3.40a 30.92±4.19b 48.921 0.000 24 h 17.50±2.31 39.83±4.67a 48.33±5.66b 154.197 0.000 72 h 17.41±2.57 31.50±4.06a 38.58±5.40b 79.974 0.000

3 討論

納洛酮注射液作為經典的阿片類受體阻滯劑，具有很高的脂溶性，能夠很好地透過血腦屏障進而作用于中樞神經系統。納洛酮注射液最早在臨床上應用是能夠對抗阿片類藥物復合麻醉恢復期或阿片類藥物過量所致的呼吸功能減弱［11］。隨著對病理生理學認識的不斷深入，學者們檢測到急性顱腦損傷病人和腦損傷模型動物的腦組織內內源性阿片肽（β-內啡肽和強啡肽等）的數值均顯著上升，內源性阿片肽的毒性作用會導致神經細胞損害的進一步加重［12］。納洛酮注射液可阻斷內源性阿片肽的毒性作用進而可以減輕腦水腫、降低顱內壓、改善腦代謝，并可以逆轉呼吸抑制［13］。臨床試驗亦表明納洛酮注射液對SHA病人［8］、高血壓腦出血病人［14］、重度顱腦損傷病人［15］、急性腦梗死病人［16］均具有腦保護作用。研究顯示，SAH模型大鼠的行為能力及其海馬CA1區神經細胞會受到損害，其可能的原因被認為是SAH后腦組織及蛛網膜下腔內源性阿片肽含量增多，導致神經細胞損傷［13］。

自噬是真核細胞的程序性死亡方式之一，也是細胞面對損傷性刺激的自我保護機制［17］。通過溶酶體蛋白降解途徑能夠有效地清除受損的細胞器和細胞內的毒性物質，并能夠為蛋白質的合成和細胞器的更新提供相應的原料，通過上述反應的發生可以很好地保持細胞的功能及結構，進而達到對抗損傷性刺激的目的［18］。在一定程度內發生的自噬可以有效地穩定細胞功能并能夠降低致死率；自噬程度不足則會損傷細胞功能與結構，進而導致損傷性結果的發生［19］。既往學者實驗結果顯示，給予SAH動物模型藥物處理能夠在一定程度上增強實驗動物海馬區神經細胞自噬，經檢測胞內出現自噬相關蛋白Beclin-1及LC3-Ⅱ的細胞數量升高，神經細胞死亡明顯減少［20］；應用藥物降低自噬程度后，在一定程度上增加了細胞致死率［21］。

現階段對于納洛酮注射液對SAH神經保護作用的文獻報道主要在臨床，基礎實驗很少，在自噬方面的實驗結果鮮有報道。該實驗經過精心設計，參考文獻采取顱內動脈刺破法制作SAH大鼠模型，并給予SAH大鼠藥物干預，結果顯示SAH后大鼠行為學功能減退，胞內出現自噬相關蛋白Beclin-1及LC3-Ⅱ的細胞數量升高，給予納洛酮注射液處理后行為學功能得到改善，胞內出現自噬相關蛋白Beclin-1及LC3-Ⅱ的細胞數量進一步升高，這與以往相關文獻［22］報道一致。

通過以上實驗，我們得到結論，納洛酮注射液能夠恢復SAH大鼠的行為學功能，其機制可能是在一定程度上增強了SAH大鼠海馬區神經細胞自噬，穩定了細胞的結構與功能。納洛酮注射液對SAH的神經保護功效，涉及相當復雜的分子機制，尚需學者不斷努力、深入探討。