超聲診斷聯合擴展性無創產前檢測在孕期胎兒染色體疾病篩查中的應用

代鵬 趙干業 時盼來 孔祥東

鄭州大學第一附屬醫院遺傳與產前診斷中心（鄭州450046）

染色體異常導致的疾病尚無有效的治療手段，通過篩查和產前診斷及早識別胎兒染色體異常對降低出生缺陷、提高人口健康、避免孕婦身心傷害、減輕家庭及社會經濟負擔尤為重要［1］。超聲檢查作為一種無創產前篩查與診斷手段，能夠在孕早中期發現胎兒嚴重結構異常或軟指標陽性，被廣泛用于臨床，但其指標陽性幾率大，指標陽性孕婦是否行穿刺術尚存爭議［2］。近年來，無創產前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）以無創、安全等優點得到了廣泛的臨床應用，緩解了產前診斷壓力［3］。該技術主要通過采集孕婦外周血游離DNA 檢測胎兒染色體疾病，對胎兒本身沒有傷害，快速獲取結果［4］。但最近研究［5］顯示NIPT 大約檢測到23%與染色體異常相關的疾病，67%臨床表型相關的染色體異常被忽略。更有研究［6］表明，15 767 例智力障礙/發育遲滯等先天異常的患病兒童中，約7.2%的患兒可能由＜10 Mb的基因組拷貝數變異（copy number variations，CNVs）引起。基因組CNVs 能夠導致染色體微缺失/微重復綜合征（microdeletion/microduplication syndrome，MMS），且其發病率與孕婦年齡無關，對于40 歲以下孕婦，染色體MMS 的發生比唐氏綜合征更常見［7］。因此，NIPT 進一步擴展到了CNVs 的額外分析［8-9］。研究顯示，染色體MMS 與胎兒超聲結構畸形和軟指標陽性密切相關［10-11］，常規超聲檢查可發現胎兒結構畸形和軟指標陽性［12］。但擴展性NIPT（NIPT-plus）是否可以作為超聲診斷異常的一線篩查手段未見相關文獻報道。因此，本研究旨在探討NIPT-plus 在超聲診斷提示胎兒結構異常或軟指標陽性的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2018年9月至2019年10月因超聲檢查提示胎兒結構異常或軟指標陽性于我中心行NIPT-plus 篩查的1 487 例不同孕期的孕婦。孕婦年齡19～42 歲，平均年齡28.6 歲，孕周為（12～32+5）周，平均孕周為（21.9±2.7）周，行超聲檢查的時間為12 周，即頸項透明層（nuchal translucency，NT）檢查及后期各個階段的超聲檢查。雙胎孕婦48 例，試管嬰兒孕婦58 例。NIPT-plus 篩查高風險孕婦要求在我中心行穿刺-染色體核型分析或全基因組拷貝數變異分析排除胎兒染色體異常，并隨訪妊娠結局。孕婦排除接受細胞治療者、腫瘤患者和一年內異體輸血者。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準（2018-016），所有孕婦均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 超聲檢查采用GE Voluson E8 或Prosound a7 超聲儀，經腹二維和三維探頭，頻率分別為1～5 MHz 和5～9 MHz。孕11～14 周查NT 厚度、胸腹臟器、脊柱、顏面、頭顱等實質性臟器，并測量胎心、羊水深度、股骨、肱骨、腹圍以及雙頂徑、頭圍、靜脈導管及臍血管等。若發現異常的行NIPT-plus檢測，并于孕中晚期行胎兒Ⅱ、Ⅲ級或胎兒心臟產前超聲篩查，按照產前診斷超聲指南，依次觀察胎兒結構和軟指標有無異常。

1.2.2 NIPT-plus 檢測采血前詳細咨詢既往病史、生育史、遺傳病史、孕期用藥情況、有毒物品和放射性物品接觸情況及夫妻雙方染色體核型等基本信息，并簽署知情同意書。采集孕婦外周血10 mL 保存在無創專用采血管；提取母體血漿游離DNA（cell-free DNA，cfDNA），使用10 ng cfDNA 構建文庫，建庫過程無需PCR 擴增。文庫定量后，在基因測序儀（Nextseq CN500，美國）進行高通量測序，生成約20 M 45 bp（37 bp+8 bp index），通過提高測序深度和加強算法，實現染色體非整倍體和CNV 分析，并設置超純水代替的空白對照，21-三體、18-三體和13-三體樣本作為陽性對照，結果采用Z值風險評分。如果NIPT-plus 結果正常，繼續定期超聲檢查。

1.2.3 侵入性產前診斷NIPT-plus 提示高風險孕婦行侵入性產前診斷。常規消毒后，在超聲引導下行絨毛穿刺術取10～15 mg 絨毛或羊膜腔穿刺術抽取羊水20 mL。CNV-seq 分析：提取樣本基因組DNA 1～1.5 μg；將DNA 打斷、擴增，構建基因組文庫；利用NEXTseq CN500 測序平臺測序，使用Burrows-Wheeler 算法將所有測序序列與hg19 基因組進行比對分析和分析數據。染色體核型分析：將羊水細胞1 600 rpm 離心10 min，在沉淀物加入羊水培養基轉移到細胞培養瓶，放置于37 ℃、5%CO2的培養箱培養7 d，更換培養液后繼續培養至10～12 d 觀察羊水細胞生長狀態。生長良好的細胞加入秋水仙素，經37 ℃低滲、固定、制片、烤片、胰酶消化、G 顯帶，利用蔡司MetaSystems Ikaros 染色體核型分析系統采集與分析染色體中期分裂相。核型按照人類細胞遺傳學國際命名體制ISCN2016 進行描述與診斷。

1.2.4 隨訪對所有孕婦，在孕晚期或新生兒出生后進行隨訪。

2 結果

2.1 染色體異常胎兒檢出情況本研究利用NIPT-plus 檢測了胎兒常見常染色體和性染色體非整倍體、相對高發的＞3 Mb 大小并位于特定癥候群相關染色體片段位置的微缺失疾病和＞10 Mb的染色體大片段缺失/重復綜合征等在內的大約100 種胎兒染色體異常疾病。1 487 例超聲異常孕婦接受NIPT-plus 篩查后，共檢出85 例為NIPT-plus高風險，檢出率為5.72%（85/1 487），其中73 例高風險孕婦行侵入性產前診斷，確診36例胎兒為染色體非整倍體或MMS，陽性預測值（positive predictive values，PPVs）為49.32%（36/73）。3 例雙胎孕婦的NIPT-plus 結果為高風險（6.25%，3/48），3 例試管嬰兒孕婦的NIPT-plus 結果為高風險（5.17%，3/58）。見表1。

表1 超聲異常孕婦行NIPT-plus 及侵入性產前診斷結果Tab.1 NIPT-plus and invasive prenatal diagnosis results of pregnant women with abnormal ultrasound例

21-三體、18-三體、13-三體和罕見單體/三體高風險孕婦行侵入性產前診斷結果為陽性的行終止妊娠，假陽性的繼續妊娠。13 例NIPT-plus 提示SCA 高風險孕婦，隨訪得知其中1 例孕婦因超聲顯示胎兒心臟血管異常行NIPT-plus 檢查高風險后未行侵入性產前診斷，孕婦孕晚期定期行超聲和其他相關檢查，胎兒心臟血管發育恢復正常且未發現任何異常繼續妊娠，出生后各項指標都正常。6 例NIPT-plus 提示DGS 高風險孕婦，隨訪得知其中1 例孕婦因超聲顯示胎兒室間隔缺損行NIPT-plus 高風險后未行侵入性產前診斷而繼續妊娠，胎兒出生后各項指標都正常。31 例NIPT-plus提示MMS 高風險孕婦，隨訪得知10 例孕婦未行產前診斷，其中3 例孕婦直接行終止妊娠，7 例孕婦在孕中晚期定期行超聲和其他相關檢查未發現其他異常進而繼續妊娠，且嬰兒出生后各項指標正常。此外，MMS 高風險孕婦行侵入性產前診斷發現部分胎兒染色體MMS 遺傳父母，因此在遺傳咨詢中發現確診為陽性MMS 的胎兒，建議父母行CNV-seq 檢測以便鑒定胎兒MMS 來源父母遺傳還是新發突變，有利于判定MMS 的致病性。NIPTplus 對罕見三體/單體的PPVs 為0，提示需要提高生物信息學算法和擴大樣本量驗證NIPT-plus 對罕見三體/單體的檢測能力，更要求檢測機構提高實驗質控和報告審核以及臨床醫生的遺傳咨詢能力，減少孕婦不必要的心理負擔。

2.2 NIPT-plus對臨床超聲異常分布的檢出率根據超聲診斷常見的結構異常或軟指標陽性，1 487例孕婦超聲異常分布見表2。NIPT-plus 對超聲胎兒結構異常或軟指標的檢出率不同，其中心臟發育其他異常、腎盂分離、室間隔缺損、NT 增厚、單臍動脈和鼻異常等檢出率最高。按PPVs 指標來看，鼻異常、囊性腫瘤、NT 增厚、腸管回聲增強和心臟發育其他異常的PPVs 高于超聲診斷提示其他胎兒結構異常或軟指標陽性見表2。

2.3 隨訪結果12 例NIPT-plus 提示高風險孕婦因擔心穿刺存在風險拒絕產前診斷，其中6 例定期產檢監測胎兒發育情況，且出生正常，3 例后期超聲檢查發現胎兒嚴重結構畸形選擇終止妊娠，3 例繼續妊娠。73 例孕婦行侵入性產前診斷，37 例為假陽性，胎兒順利分娩，新生兒各項指標正常；36 例確診孕婦中，19 例21-三體、5 例18-三體、2 例性染色體非整倍體和2 例MMS 的孕婦選擇終止妊娠，其他確診孕婦選擇繼續妊娠或已順利分娩。

對NIPT-plus 提示低風險孕婦建議遺傳咨詢，并孕期定期超聲檢查密切監測胎兒發育情況，如超聲發現胎兒出現嚴重結構畸形或軟指標陽性，建議孕婦進一步行有創性產前診斷，最大程度減少假陰性病例的出生。1 402 例NIPT-plus 低風險孕婦中，電話隨訪有效者1 279 例（隨訪91.2%），其中482 例胎兒順利分娩，且新生兒體檢各項指標正常，784 例胎兒后期超聲檢測指標逐漸恢復正常且處于妊娠狀態，13 例胎兒結構異常或胎死宮內引產，但實驗室診斷結果為染色體正常。截至2020年2月未發現已出生的新生兒異常。

3 討論

染色體病和染色體MMS 是嚴重出生缺陷的主要原因，我國每年出生此類患兒近30 萬，給家庭、社會和國家帶來沉重負擔［13］。染色體MMS 常見的臨床表現包括生長發育遲緩、智力障礙、自閉癥、多發畸形和功能障礙等［14-15］。因此，產前篩查與診斷是防控這類疾病的最有效途徑。研究顯示，胎兒鼻骨異常或缺失等微小畸形均與染色體MMS常密切相關［16］，所以對超聲診斷結構異常或軟指標陽性的胎兒進行產前檢查具有重要的臨床意義［17-18］。NIPT的出現提高了篩查的準確性，減少了孕婦不必要的穿刺術和心理負擔以及出生缺陷的發生，但常規NIPT只篩查21、18和13-三體綜合征，僅占染色體疾病的20%左右，剩余的大部分染色體異常綜合征被忽視，特別CNVs［5-6］。LEFKOWITZ等［19］從1 210 例孕婦中發現240 例胎兒超聲異常行NIPT，其中34 例（14.2%，34/240）胎兒為21-三體綜合征，6 例（2.5%，6/240）胎兒為18-三體綜合征，10例（4.2%，10/240）胎兒為13-三體綜合征，16 例（6.7%，16/240）胎兒為性染色體非整倍體異常，22例（9.2%，22/240）胎兒為染色體拷貝數變異，超聲異常在所有孕婦行NIPT 的檢出率為7.3%（88/1 210）。LIANG 等［20］對94 085 名單胎妊娠女性的胎兒異常進行前瞻性研究，評估NIPT-Plus 在染色體非整倍體和全基因組MMS 檢測中的臨床表現，共發現1 128 例（1.2%）具有臨床意義的胎兒染色體異常，包括965 例染色體非整倍體（1.026%）和163 例（0.174%）MMS，且具有較好的PPVs，因此作者建議將NIPT-plus 作為臨床一線妊娠篩查技術。本研究分析了1 487 例因超聲異常孕婦行NIPT-plus篩查結果，共發現85 例孕婦胎兒篩查結果為高風險，檢出率為5.72%，包括35 例常染色非整倍體，13 例性染色體非整倍體和37 例MMS。但本研究只分析了超聲異常孕婦的NIPT-plus 結果，未在超聲檢測正常或未行超聲檢測的病例中進行NIPTplus 檢測分析。

表2 超聲異常的臨床分布及NIPT-plus 篩查陽性例數和PPVsTab.2 Clinical distribution of ultrasound abnormalities and the positive number of NIPT-plus screening and PPVs例

NIPT-plus 不僅可以檢測常見的染色體非整倍性，還可檢測罕見的常染色體非整倍體［21］。然而，本研究中，NIPT-plus 篩查高風險的罕見三體/單體經侵入性產前診斷均為假陽性，增加了侵入性操作。LIANG 等［20］從94 085 例單胎妊娠女性的胎兒異常中發現49 例非常見常染色體非整倍體，其中35例為假陽性，PPVs較低。FIORENTINO等［22］研究12 114 例孕婦行NIPT 檢測，17 例為常染色體罕見三體，其中10 例進行了侵入性產前診斷，確診3 例胎兒為限制性胎盤嵌合，未行侵入性產前診斷1 例后期診斷為15 號染色體的UPD（uniparental disomy，單親二倍體），罕見三體的PPVs 也較低。因此，NIPT-plus 確定的大多數罕見三體/單體高風險的孕婦可能不需要進行侵入性產前診斷，否則增加了過度診斷的風險，但此類數據也許具有重要的臨床意義，有助于改善妊娠管理。FIORENTINO等［22］研究顯示NIPT-plus 提示罕見三體高風險的胎兒可能存在限制性胎盤嵌合或UPD 風險，需要進行連續超聲檢查以監測胎兒的生長發育，排除宮內生長受限。

鑒于以上分析，NIPT-plus 是否推薦為超聲診斷異常孕婦的一線篩查手段需要進一步擴大樣本量驗證。但根據相關文獻和本研究結果，筆者建議將NIPT-plus 作為超聲診斷異常孕婦進行產前篩查的備選技術。對NIPT-plus 低風險的孕婦后期定期行超聲診斷等相關檢查，監測胎兒發育情況。對NIPT-plus 高風險的孕婦建議羊水穿刺行胎兒染色體核型或全基因組拷貝數變異檢測，降低先天性缺陷兒的出生。