清開靈注射液對腦缺血大鼠急性期病理形態學、炎癥因子及凋亡基因Bcl-2和p53表達的影響?

單潔齡 李志強 吳書菊△

（1.上海市浦東新區浦南醫院，上海 200125；2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200021）

缺血性腦血管病是世界范圍內常見的高危疾病，約占腦血管疾病的70%～80%，是因腦部血液循環障礙引發缺血、缺氧，導致局部腦組織變性壞死，腦組織受損［1］。腦缺血在發生和發展中多伴有炎癥反應，在急性期尤為明顯。凋亡是腦缺血神經元死亡的主要方式，是目前腦缺血機制研究的熱點。目前研究認為，Bcl-2和p53是最重要的調控基因［2］。中醫學認為急性期腦缺血的機制為痰瘀互結、兼夾氣血不足、脾胃升降失調，所致腦脈不通，治宜活血醒腦開竅［3-4］。清開靈注射液具有清熱解毒、化痰通絡、醒神開竅之功效，用于治療熱病神昏、中風偏癱、神志不清等腦血管病，具有較好的臨床療效［5］，但其作用機制研究尚不明確。本研究旨在觀察清開靈注射液對腦缺血模型大鼠急性期的腦組織病理學、炎癥因子及腦細胞凋亡相關蛋白的影響，旨在為臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量（200±20）g，購于上海邦耀生物科技有限公司，動物許可證號：SYXK（滬）2018-0034。置于（23±2）℃室溫中，晝夜節律，自由飲水進食，適應環境7 d后于9∶00～17∶00進行實驗。

1.2 藥物與儀器

清開靈注射液（廣州白云上制藥有限公司，批號181205）；尼莫地平注射液（上海信誼金朱藥業有限公司，批號190407）；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司），蘇木素和伊紅以及TTC（Sigma公司）、BCA蛋白定量試劑盒和trizol試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、兔p53和Bcl-2抗體（Sigma公司），PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；免疫組組織化學試劑盒購于凋亡試劑盒和DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；GAPDH抗體購與Cell Signaling Technology公司；PBS緩沖液和二抗由碧云天生物技術研究所提供；其他試劑均為分析純購于天津市廣成化學試劑有限公司；氯化鈉注射液（批號07112133）由山東康寧藥業有限公司提供，實驗用水為超純水。

1.3 分組與造模

將評分相近的60只SD大鼠隨機分為4組，每組15只，即假手術組、模型組、陽性組和實驗組。參考文獻［6］制備腦缺血大鼠模型，將除假手術組外的大鼠，采用水合氯麻醉，俯臥固定于手術臺，采用改良線栓法制作腦缺血大鼠模型，分組分籠飼養，不禁食水。假手術組大鼠僅用玻璃分針游離出雙側頸總動脈不做結扎處理。造模成功后7 d，陽性組給予尼莫地平注射液10 mg/kg腹腔注射；實驗組給予清開靈注射液50 mg/kg腹腔注射，對照組和模型組均給予同體積的0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，連續7 d。

1.4 神經功能評分 采用BBB運動功能評分［7］評價運動功能，于術后7 d后對各組大鼠進行神經行為學評分并記錄結果，分為各關節活動能力、后肢步態及協調能力以及運動過程中爪的精細動作等3部分，共21分，評分越高運動功能越理想。采用Garcia評分法［8］對各組大鼠神經功能進行評分，總分計3～18分，得數越低，損傷程度越重。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 腦組織梗死情況及神經細胞凋亡檢測 造模7 d后，頸椎脫臼法處死大鼠后迅速剝取腦組織，置于-20℃冰箱中15 min。取出腦組織，剝離海馬CA1區，0.9%氯化鈉注射液清洗，固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片。取切片置于2%TTC染色液中染色，避光孵育30 min，10%甲醛固定，通過經圖像分析系統測量腦梗死面積。其中梗死的腦組織呈白色，正常的腦組織為紅色。取切片脫蠟脫水，置于TUNEL試劑盒反應液和復合液中進行DAB顯色，蘇木素染色5 min后封片，陰性對照置于蒸餾水中，顯微鏡下觀察神經細胞凋亡情況，選取5個400倍視野分別計數凋亡細胞數目。

1.5.2 炎癥因子的測定 7 d后收集3 mL腹動脈血液，離心，分離血清，ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）以及白介素-18（IL-18）炎癥因子水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5.3 凋亡基因測定 稱取200 mg腦組織進行樣品制備，trizol法提總RNA，取1 g總RNA進 行逆轉錄cRNA合成，嚴格按照逆轉錄試劑盒和相關引物的說明書加入相應量的試劑進行聚合酶鏈反應，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用全自動數碼凝膠分析儀檢測目的cRNA。BCA法測定蛋白濃度，Western blotting檢測Bcl-2表達水平，免疫組織化學法檢測p53表達水平。

1.6 統計學處理

表1 RT-PCR相關參數

應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（）表示，采用t檢驗比較組內和組間差異；計數資料以（%）表示，應用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能評分和神經行為學評分比較

見表2。與假手術組比較，模型組大鼠的BBB評分和神經功能評分明顯低于假手術組（P＜0.05）。給予藥物干預后，陽性組和實驗組大鼠的BBB評分和神經功能評分明顯高于模型組（P＜0.05），兩組大鼠的BBB評分和神經功能評分間比較均有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 各組大鼠的BBB評分和神經功能評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠的BBB評分和神經功能評分比較（分，±s）

與假手術組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術組模型組陽性組實驗組n 10 10 10 10 BBB評分19.40±2.04 8.27±1.34*13.14±0.81*#15.62±0.76*#神經功能評分16.50±2.00 8.08±1.21*12.08±1.19*#14.25±0.92*#

2.2 各組大鼠腦組織梗死體積及神經細胞凋亡情況比較

見表3。假手術組大鼠的腦組織細胞未見明顯病理改變、神經元排列緊密整齊，核仁明顯可見，居中，細胞膜清晰。模型組腦組織神經元明顯減少，結構模糊構型紊亂，不規則出現不同程度變性壞死及炎細胞浸潤、核體固縮深染；與模型組相比，陽性組和實驗組的神經元均明顯增多，有不同程度的緩解恢復，核固縮核體均有不規則程度的減輕，間質水腫減輕，細胞結構較完整，見圖1～圖2。與假手術組比較，模型組大鼠的腦梗死體積和神經細胞凋亡明顯升高（P＜0.05），給予藥物治療后，陽性組和實驗組的腦梗死體積和神經細胞凋亡水平明顯降低（P＜0.05），兩組間比較均有顯著性差異（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦梗死體積及神經細胞凋亡比較（±s）

表3 各組大鼠腦梗死體積及神經細胞凋亡比較（±s）

組別假手術組模型組陽性組實驗組n 15 15 15 15腦梗死體積（%）0.00±0.00 45.37±4.38*32.03±5.01*#33.95±3.96*#神經細胞凋亡（個）11.12±1.87 65.28±7.26*30.98±3.42*#32.15±4.05*#

圖1 各組大鼠的腦組織病理圖（TTC，400倍）

圖2 各組大鼠的腦組織梗死面積比較

2.3 各組大鼠炎癥因子水平比較

見表4。與假手術組比較，模型組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-18水平明顯升高（P＜0.05）。給予藥物干預后，陽性組和實驗組大鼠的炎癥因子水平明顯降低（P＜0.05），兩組大鼠的炎癥因子比較有顯著性差異（P＜0.05）。

表4 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

與陽性組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術組模型組陽性組實驗組n 15 15 15 15 TNF-α 45.89±6.16 124.75±12.08*75.09±9.14*#64.28±7.32*#△IL-1β 34.53±4.67 106.72±13.85*64.66±7.54*#55.69±6.71*#△IL-6 26.12±2.67 78.47±7.86*50.57±4.45*#42.87±3.09*#△IL-18 23.14±2.59 61.23±6.12*40.47±5.74*#35.12±3.26*#△

2.4 各組大鼠凋亡基因Bcl-2和p53表達比較

見表5，圖3。與假手術組比較，Bcl-2基因表達和Bcl-2蛋白表達的相對豐度值明顯降低，具有顯著差異（P＜0.05），模型組大鼠的凋亡基因p53基因表達和p53蛋白表達的相對豐度值明顯升高（P＜0.05）。給予藥物干預后，Bcl-2基因表達和Bcl-2蛋白表達的相對豐度值明顯高于模型組（P＜0.05），陽性組和實驗組大鼠的p53基因表達和p53蛋白表達的相對豐度值明顯低于模型組，兩組比較均有顯著性差異（P＜0.05）。

表5 各組大鼠凋亡基因Bcl-2和p53表達比較（分，±s）

表5 各組大鼠凋亡基因Bcl-2和p53表達比較（分，±s）

組別假手術組模型組陽性組實驗組n 15 15 15 15 Bcl-2基因表達0.86±0.15 0.21±0.06*0.68±0.18*#0.73±0.10*#△蛋白表達的相對豐度值0.97±0.11 0.39±0.09*0.74±0.12*#0.87±0.17*#△p53基因表達1.21±0.16 15.37±1.38*9.53±1.11*#8.72±1.52*#△蛋白表達的相對豐度值0.33±0.14 1.12±0.07 0.78±0.10*#0.62±0.09*#△

圖3 各組大鼠的凋亡相關蛋白電泳條帶

3 討 論

腦缺血病理生理變化與炎癥因子及氧自由基大量產生、細胞內Ca2+超載、凋亡相關蛋白表達的啟動等多方面因素密切相關［9］。神經功能和神經行為學指標對腦缺血疾病的研究具有重要作用，可真實反映腦缺血疾病程度。炎癥在腦缺血病程進展中發揮著重要作用，腦缺血可打破促炎和抗炎反應間的動態平衡，且炎癥標志物水平與預后不良密切相關［10-11］，研究發現，腦缺血的炎癥反應是一個動態過程，腦部缺血中心區的壞死組織因大量的炎癥介質及炎癥因子的釋放，激活免疫應答，加重炎癥反應，而炎癥反應釋放大量的氧自由基、一氧化氮、興奮性氨基酸等毒性物質，相互作用明顯造成腦組織不可逆的損傷，可誘發神經細胞凋亡，最終導致腦細胞凋亡甚至壞死，加重腦損傷［12］。TNF-α是炎癥反應的起始因子，具有多效促炎性及神經毒性作用，導致內皮細胞功能失調，致使內皮細胞屏障的滲透性增加［13］。IL-1β是腦缺血狀態下由星形膠質細胞等大量分泌而成的，參與炎癥級聯擴大反應，是腦缺血早期炎癥反應的重要炎癥因子，是腦缺血損傷的病理生理基礎。而且IL-1β的激活會促進TNF-α分泌，同時二者會增加其他炎癥因子表達，導致腦損傷程度加重。IL-6為炎癥遞質，可加重腦缺再灌注的全身反應和局部損傷。IL-18參與了急性腦損傷的病理生理過程，且其血清中含量與腦損傷程度密切相關，對于臨床診斷預后判斷和提高患者救治水平有重要意義［14］。細胞凋亡是指機體受刺激后一系列基因參與的細胞自主有序的程序性死亡，Bcl-2、P53等是細胞凋亡啟動的關鍵。Bcl-2為高度同源蛋白中的經典的抗凋亡蛋白，在細胞凋亡進程中發揮著重要的調節作用，在調控細胞自噬的過程中也有重要作用［15］。此外，Bcl-2還能調控氧化應激誘導自噬和凋亡［16］。p53作為轉錄因子可通過調節多種基因的轉錄參與誘導細胞凋，是調控的凋亡蛋白中的重要成員之一［17］。

腦缺血屬于中醫學“中風”范疇，痰瘀互結、腦脈不通為病機，氣血、脾胃升降失調，治宜活血醒腦開竅。清開靈注射液方中水牛角粉清熱定驚、涼血解毒、為君藥。膽酸、豬去氧膽酸清熱解毒、息風止痙、開竅豁痰；梔子、板藍根、黃芩、金銀花清熱解毒，燥濕瀉火，共為臣藥。佐以珍珠母清心肝之火而明目。諸藥相合，共奏清熱解毒、化痰通絡、醒神開竅之功。現代藥理發現［18-20］，水牛角有明顯的抗炎作用，可用于炎癥性疾病的治療；黃芩苷可通過調控線粒體自噬減輕胞神經元細胞缺血缺氧再灌注損傷；梔子中的活性成分梔子苷和西紅花苷I，可通過改善線粒體的能量代謝抗氧化抗炎抑制細胞凋亡等途徑在腦缺血的治療中發揮作用，而且黃芩苷梔子苷配伍可通過抑制興奮性氨基酸的釋放而發揮腦保護作用。

本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠的神經功能評分、神經行為學評分明顯降低，大鼠的腦組織神經元明顯減少，結構模糊構型紊亂，不規則出現不同程度變性壞死及炎細胞浸潤、核體固縮深染，腦梗死體積、神經細胞凋亡、TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL18水平。給藥后，陽性組和實驗組大鼠的神經元均明顯增多，有不同程度的緩解恢復，核固縮核體均有不規則程度的減輕，間質水腫減輕，細胞結構較完整，神經功能評分和神經行為學評分明顯升高，腦梗死體積、神經細胞凋亡、炎癥因子水平明顯低于模型組，提示清開靈注射液能有效地提高腦缺血大鼠的神經功能和神經行為學指標，減少腦梗死體積和神經細胞凋亡，降低炎癥因子水平。與假手術組比較，模型組大鼠腦部Bcl-2表達顯著下調，p53表達顯著上調。給予藥物干預后，陽性組和實驗組的大鼠腦部Bcl-2蛋白水平顯著上調，p53表達顯著下調，提示清開靈注射液能有效地調整凋亡相關因子表達，減少腦部細胞的死亡，激活腦細胞自我保護。

綜上所述，清開靈注射液對腦缺血模型大鼠可有效地減少腦梗死面積，保護腦組織免受炎癥因子的損傷，調整凋亡相關因子表達，減少神經細胞的凋亡，激活腦細胞自我保護。