椿根皮體外抑菌和活性部位的研究?

王婉卿 王 偉 王 雷

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.山東中醫藥大學第二附屬醫院，山東 濟南250001）

椿根皮，又名椿皮、樗白皮，即苦木科植物臭椿Ailanthus altissima（Mill.）Swingle的干燥根皮或干皮。其性味苦、澀、寒，入大腸、胃、肝經，具有清熱解毒、燥濕止帶、收斂止血、澀腸止瀉的功效，臨床上常用于治療赤白帶下、崩漏等婦科病癥以及濕熱泄瀉、瀉痢不止、便血等消化道病癥［1］?，F代研究證實其作用主要有抗病毒、殺菌、解熱、消炎、抗瘧疾、抗癌等［2］，在治療陰道炎、子宮頸及內膜炎、滴蟲性陰道炎、女陰炎等婦科疾病以及因細菌感染引起的痔瘡、結腸炎等消化系統疾病方面療效顯著。

目前關于椿根皮藥用價值的研究主要局限于其抗病毒、抗腫瘤、殺蟲的作用，至于椿根皮對細菌、真菌的抑制作用，研究方向也集中于對其特征性生物堿的分離提純［3］，而對椿根皮的整體抑菌性研究目前尚未見詳細報道；關于椿根皮抑菌成分的提取方法亦無系統的研究結論；藥典對椿根皮治療相關疾病的用量規定也與古籍效方差異較大。綜合中醫對椿根皮能清熱解毒、收澀止帶、燥濕止瀉的藥效認識，以及現當代研究確定其藥用成分具有解熱、驅蟲［4］、消炎、殺菌、抗病毒的作用，筆者將通過紙片擴散法對椿根皮的水提物、50%醇提物、70%醇提物、80%醇提物及95%醇提物的抗菌效果進行比較，確定其抑制菌種，進一步開拓和證實椿根皮抑菌性最顯著的活性成分，探索椿根皮水提物和不同濃度的醇提物的最佳提取工藝，為開發抑菌類新藥以及椿根皮治療細菌感染的相關臨床應用提供相關的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 游標卡尺；計時器；水煎鍋；旋轉蒸發儀；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵；凍干機；恒溫水浴箱；離心機；數控超聲波清洗器；十萬分之一電子天平；恒溫培養箱；超凈工作臺。

1.2 藥物與試劑 椿根皮飲片；乙醇（天津市富宇精細化工有限公司）；牛肉膏（北京奧博星生物技術有限責任公司）；氯化鈉（天津市富宇精細化工有限公司）；蛋白胨（北京奧博星生物技術有限責任公司）；瓊脂粉（北京奧科斯生物技術有限責任公司）；NaOH（國藥集團化學試劑有限公司）；HC（l國藥集團化學試劑有限公司）；麥芽膏粉（北京奧博星生物技術有限責任公司）；氯霉素；大腸桿菌（Eco）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Sau）、綠膿桿菌（Pae）、白色念珠菌（Cal）（均由山東中醫藥大學實驗中心提供）

1.3 椿根皮提取物制備 1）不同濃度醇提物的制備。清洗藥材，晾干，粉碎，過篩；定量稱取椿根皮生藥4份，分別加入95%、80%、70%、50%乙醇，按照料液比為1∶10進行提取，過濾，3 000 r/min離心，取上清液，并進行濃縮至浸膏［5］備用。2）水提物的制備。粉碎藥材，定量稱取并水煎提3次，每次2 h，過濾；濾液以3 000 r/min離心10 min，取上清液并濃縮至適量（0.5 g生藥/mL），高壓滅菌后密閉封裝，4℃備用。

1.4 紙片擴散法實驗 1）無菌紙片及陽性對照、陰性對照紙片的制備。打孔器將新華1號濾紙制備為直徑6 mm的圓形紙片，取50片放入一清潔干燥的錐形瓶內，瓶口以棉塞密閉后，用雙層報紙進行包扎。121℃高壓滅菌30 min，再置于100℃干燥箱內烘干放涼備用［6-8］。陽性對照藥為青霉素，將其稀釋成100 μg/mL置于滅菌青霉素瓶中，將用于陽性對照的紙片干燥后置于其中浸泡4 h，37℃干燥1 h后備用。陰性對照紙片滴加相應組別的溶劑（超凈臺紫外滅菌）備用。2）菌種活化。將試驗菌菌種用接種環從保存菌種的培養基上挑取并劃線接種于多根斜面培養基上［9］，本次實驗采用二代菌種，菌種的保存是于4℃下保存。3）菌懸液制備。用接種環刮取新鮮菌落懸浮于10 mL 0.9%氯化鈉注射液（121℃高壓滅菌15～20 min）中混勻，稀釋至菌液濃度為2×105、2×106cfu/mL。4）培養基制備。（1）營養瓊脂培養基的制備。營養瓊脂培養基的配制比例為牛肉膏0.5 g/100 mL，氯化鈉0.5 g/100 mL，蛋白胨1 g/100 mL，瓊脂粉2 g/100 mL。按上述比例配制營養瓊脂培養基并加入相應比例的蒸餾水溶解，將以上材料煮至微沸，趁熱用NaOH（2 mol/L）將pH調至7.0并用pH試紙鑒定其酸堿度［10］。培養基冷卻至50℃后，在無菌操作臺中向培養皿傾倒培養基。倒入培養皿中的液態營養瓊脂培養基應當完全自然覆蓋皿底，厚度為4 mm（允許±1 mm誤差）。每次制成培養基平板均需檢定后再使用，新制平板培養基其含水量多而不利于藥敏試驗數據的準確性，應待培養基冷卻凝固后倒扣于37℃恒溫培養箱中培養24 h。若24 h后培養基平板沒有長菌則可以用于藥敏試驗。（2）麥芽汁培養基的制備。麥芽汁培養基的配制比例為麥芽膏粉130 g，瓊脂15 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 000 mL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，調節pH值約為（6.0±0.2），分裝三角瓶，115℃高壓滅菌15 min，待冷卻至55～60℃時，按照上述營養瓊脂培養基的操作方法進行分裝。然后放置于27℃恒溫培養箱中，培養24 h。24 h后培養基平板沒有長菌則可以使用。

1.5 抑菌環實驗 在超凈工作臺中，將吸取校正的菌懸液200 μL滴于培養基（細菌選取營養瓊脂培養基，真菌選取改良馬丁培養基）表面，用攤涂棒涂抹均勻，每次旋轉平皿60°，在平皿周邊涂2圈，保證均勻涂布。用滅菌的加樣槍分別加入10 μL的稀釋成1、0.5、0.25、0.125 mg/mL質量濃度梯度的椿根皮50%醇提物，分別滴于4張無菌紙片上，每種溶液重復3次，待紙片干后將同濃度的紙片分別貼于同一培養基的四周，一張陰性對照紙片（其滴加的藥品為無菌生理鹽水）貼于中央，各紙片距離＞24 mm，與平皿邊緣＞15 mm。按上述方法共制備成4個椿根皮50%醇提物紙片培養基，且4個培養基的紙片藥物質量濃度呈加倍梯度變化。按照上述方法對稀釋為同樣濃度梯度的椿根皮70%醇提物、80%醇提物、95%醇提物和水提物也用加樣槍分別加至相應的紙片，并待晾干后貼至相應的培養皿。將陽性對照紙片貼于各菌種單獨制備的相應培養皿中作為陽性對照，其紙片貼敷方法為四周貼陽性對照紙片，中間貼陰性對照紙片（其滴加的藥品為無菌生理鹽水）。37℃恒溫培養箱培養18～24 h（真菌放置于27℃恒溫培養箱培養24 h）后測量抑菌圈的大小，所有結果取平均值計算。紙片一旦接觸瓊脂不應再移動位置。紙片平板應在15 min內翻轉，在恒溫培養箱中平板最多2個疊起，確保受熱均勻。觀察一系列濃度的樣品濾紙片周圍抑菌環的有無，用游標卡尺測量抑菌環直徑，確定MIC。用游標卡尺測量抑菌環直徑，結果取平均值，抑菌環直徑＞7 mm者計為有抑菌作用，≤7 mm者計為無抑菌作用，3次重復試驗均達到有抑菌作用結果者，判為合格。陰性對照組應無抑菌環產生，否則試驗無效。

2 結 果

椿根皮不同提取方法得到的提取物對Sau、Eco、沙門氏菌、Pae和Cal有不同的抑菌效果（見圖1），其中對Sau抑菌效果最好，椿根皮醇提物最小抑菌質量濃度為0.125 mg/mL，而椿根皮水提物的最小抑菌質量濃度為0.25 mg/mL。椿根皮各質量濃度醇提物和水提物對沙門氏菌無抑菌作用。所有陰性對照組菌株均正常生長，沒有抑菌環。椿根皮水提物及各濃度醇提物對Sau、Eco、沙門氏菌、Pae和Cal的MIC結果詳見表1，椿根皮水提物及各濃度醇提物對Sau、Eco、沙門氏菌、Pae和Cal的抑菌結果詳見表2。

圖1 椿根皮提物及各濃度醇提物對Sau、Eco、沙門氏菌、Pae和Cal的抑菌效果

3 討 論

實驗結果表明椿根皮水提物對Sau及Cal有一定抑殺作用，對Eco、沙門氏菌和Pae均無抑殺作用。椿根皮醇提物因濃度不同，對Sau、Eco、Pae和Cal有不同程度的抑殺效果，但在抑殺沙門氏菌方面，只有95%椿根皮醇提物有較明顯的抑菌作用。朱玉鳳等的研究結果表明，椿皮水提取物能微弱抑殺Sau而不能抑殺Pae、Eco［11］；陳元坤等研究稱臭椿皮水煎液對 Eco、沙門氏菌無抑菌作用，對葡萄球菌有一定抑制作用［12］。本實驗結果與上述兩點研究結果較為一致，同時本實驗也證實了椿根皮醇提物在針對Sau、Eco等常見菌種的抑殺方面其效果要優于椿根皮水提物的抑菌效果。尤其是針對椿根皮水提物無法抑殺的Eco和Pae，70%和95%椿根皮醇提物的抑菌效果均比較顯著。這一實驗結果為研制椿根皮抑菌方面的新藥無疑提供了新的研究方向和開發領域。至于95%椿根皮醇提物在1 mg/mL質量濃度下對沙門氏菌有一定的抑菌作用的實驗結果，由于與以往研究文獻略有出入，還需要進一步開展對照實驗分析其重復性和穩定性。

表1 椿根皮水提物及各質量濃度醇提物對Sau、Eco、沙門氏菌、Pae和Cal的MIC結果

實驗結果還表明，在不同質量濃度的椿根皮醇提物抑菌效果的比較中，椿根皮95%醇提物和80%醇提物的抑菌效果更佳；研究表2可以發現，濃度較高的醇提物其抑菌效果略優于濃度較低的椿根皮提取物。因此，可以推斷椿根皮的抑菌部位多為醇溶性成分，而95%醇提物中有效成分純度較高，效果較好；80%醇提物抑菌譜較廣泛，在椿根皮多種質量濃度的醇提物中抑菌效果略優。但醇提物的乙醇濃度與抑菌效果并非正相關，這一點在椿根皮醇提物對Eco和Pae的抑菌效果的表現上尤為突出。本項目的實驗結果顯示，70%椿根皮醇提物對上述兩個菌種的抑制效果比80%椿根皮醇提物更為顯著，這可能與70%椿根皮醇提物對菌種的特殊選擇性有關，也可能與抑殺Eco的有效成分（如苦木生物堿［13］）在70%乙醇中溶解度較高有關。

表2 椿根皮水提物及各質量濃度醇提物對Sau、Eco、沙門氏菌、Pae和Cal的抑菌結果

另外通過統計學分析可以發現當質量濃度從1 mg/mL減為0.5 mg/mL時，椿根皮提取物的抑菌效果下降比其他相鄰濃度差對抑菌效果的影響更為明顯。因此，在實驗研究影響臨床用藥時，這一數據可以給予藥品開發者更有意義的研究思路。

椿根皮對Sau、Eco、Pae和Cal均有抑殺作用，用椿根皮治療陰道炎、子宮頸及內膜炎、滴蟲性陰道炎、女陰炎等婦科病及因細菌感染引起的痔瘡、結腸炎、久痢久泄、腸風便血［14-16］等消化系統疾病有一定科學依據。椿根皮醇提物的抑菌效果優于水提物，因此在開發與椿根皮提取物相關的抑菌產品時，在椿根皮醇提方法與成分分離方面進一步開展研究，可以想見其較廣泛的應用前景。但是關于椿根皮確切的抑菌活性，還有待進一步開展體內抑菌試驗研究加以證實。