二冬膏對LPS誘導小鼠肺泡巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6及AQP1的影響

董永強 夏雪竹△ 劉翠紅 管 濤 陳占功

（1.北京中醫醫院，北京 100010；2.首都醫科大學附屬北京佑安醫院，北京 100069；3.北京醫院國家老年醫學中心，北京 100730）

二冬膏是我國經典的滋陰養肺方，由天冬、麥冬組成，用于治療肺陰不足引起的燥咳痰少、痰中帶血、鼻干咽痛，具有抗炎、增強免疫等藥理作用［1］。研究表明，二冬膏能夠減輕急性肺損傷大鼠肺組織水腫，改善肺部病理炎癥［2］。急性肺損傷是由各種直接或間接致傷因素導致的肺組織結構和功能的損傷，主要表現為大量中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤以及肺毛細血管內皮和肺泡上皮細胞屏障功能紊亂［3］。其中肺泡巨噬細胞是推動急性肺損傷病理進程的關鍵細胞，肺泡巨噬細胞的募集、活化是導致肺部炎性因子大量釋放的重要誘導因素［4-5］。為了進一步研究二冬膏改善急性肺損傷肺部炎癥的作用，本文以LPS誘導的肺泡巨噬細胞為對象，考察二冬膏含藥血清對肺泡巨噬細胞中一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素-6（IL-6）的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠40只，雌雄不拘，體質量180～220 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2014-0004。動物飼養于12 h光照和12 h黑暗光照周期的環境內，自由飲食飲水，飼養環境溫度（24±2）℃。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

1.2 試藥與儀器 二冬膏按《中國藥典》（2015年版）配方制備，由天冬和麥冬等比例組成，加水煎煮3次后合并煎液，過濾、濃縮后與煉蜜混合呈黃棕色濃稠煎膏劑，生藥質量濃度為1.0 g/mL。天冬、麥冬均購于亳州中藥材市場。RPMI-1640培養基、胎牛血清購于美國Gibco公司；脂多糖（LPS）、MTT［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide］購于美國Sigma公司；TRIzon總RNA提取試劑購于北京康為世紀生物科技有限公司；iTaqTMUniversal SYBR Green supermix購于美國BIO-RAD公司；5×all in one RT-MasterMix購于上海斯信生物科技有限公司；NO測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；小鼠TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購于南京翼飛雪生物科技有限公司；一抗水通道蛋白1（AQP1）、Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子（MyD88）、核轉錄因子κB p65（NF-κB p65）、β肌動蛋白（β-actin）及二抗HRP標記羊抗兔IgG（H+L）購于沈陽萬類生物科技有限公司。

1.3 細胞培養 將小鼠肺泡巨噬細胞MH-S細胞（美國ATCC）于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養，培養條件為37℃、5%CO2恒溫培養箱。待細胞生長至對數生長期時，將細胞接種于96孔板或6孔板中繼續培養。

1.4 含藥血清制備 40只SD大鼠隨機分為4組，每組10只：空白組、二冬膏低劑量組（2 g/kg）、二冬膏中劑量組（4 g/kg）、二冬膏高劑量組（8 g/kg）。大鼠適應性飼養1周后開始灌胃給藥，每日2次，空白對照組給予10 mL/kg生理鹽水。連續給藥3 d后，在末次給藥1 h后腹主動脈取血，每只大鼠采血量約為5 mL，血液室溫下靜置2 h后，于3 000 r/min下離心10 min，取同組上層血清混勻后即得二冬膏含藥血清。

1.5 MH-S細胞活力檢測 采用MTT法檢測，取對數生長期的MH-S細胞制成5×104個/mL的細胞懸浮液，接種于96孔板中，每孔100 μL，隨行設置空白對照孔（只含100 μL培養基）。6 h后，棄去培養基，每孔加入180 μL無血清培養基，調零孔每孔加入20 μL不含血清培養基，其余各孔分別加入20 μL含藥血清，每組設置6個復孔。繼續培養6、12、24 h后，棄去培養基，每孔加入MTT溶液（0.5 mg/mL）100 μL繼續培養4 h后棄去上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，充分溶解反應產物后，于490 nm處測定吸光度值，實驗重復3次。

1.6 Western blotting法檢測MH-S細胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1蛋白表達 取對數生長期的MH-S細胞制成1×105個/mL的細胞懸浮液，接種于6孔板中，每孔2 mL。接種6 h后，棄去培養基，每孔加入1 800 μL無血清培養基，空白孔及模型孔加入空白組大鼠血清200 μL，其余孔分別加入二冬膏低、中、高劑量含藥血清200 μL，模型組及二冬膏各劑量組每孔另加0.5 mg/mL的LPS溶液2 μL。另設一孔加入200 μL PBS作為陰性對照。繼續培養24 h后，無菌管收集細胞培養上清進行細胞因子的檢測。細胞用預冷的PBS洗滌2次后，每孔加入含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液100～150 μL，裂解后將細胞小心刮下離心取上清，BCA法檢測細胞蛋白的濃度。調整蛋白濃度，取相同總量的蛋白進行SDS-PAGE電泳、轉膜。轉膜后用4%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST清洗后加入一抗稀釋液于4℃孵育過夜，TBST清洗后加入二抗稀釋液室溫孵育2 h，TBST清洗后進行化學發光、顯影、定影。采用Image Pro-Plus 6.0軟件分析電泳條帶灰度值，以目的蛋白與β-actin灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.7 RT-PCR檢測MH-S中TNF-α、IL-6及AQP-1 mRNA表達 按照上述方法進行MH-S細胞的接板、給藥。給藥24 h后，棄去上清液，用預冷的無菌PBS緩沖液洗滌2次，加入TRIzon總RNA提取試劑提取RNA。RNA逆轉錄參照逆轉錄試劑盒說明書將試劑混勻，放入逆轉錄儀器中進行轉錄。逆轉錄所得產物直接進行熒光定量PCR，參照試劑盒說明書在專用低位PCR反應孔板中加入相關反應物，引物序列見表1，參照試劑盒說明書進行反應。以β-actin為內參，所得結果將原始值進行2-ΔΔCt轉換后進行統計學處理。

表1 引物序列

1.8 細胞上清液NO、TNF-α及IL-6含量的檢測 按照相關試劑盒說明書操作，繪制標準曲線，分別計算各細胞因子的含量。

1.9 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（）表示，采用單因素方差分析對數據進行顯著性檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組MH-S細胞存活率的比較 見表2。與空白組相比，二冬膏低、中、高劑量組在干預24 h內對MHS細胞的存活率沒有明顯影響（P＞0.05）。

表2 各組MH-S細胞存活率的比較（%，±s）

表2 各組MH-S細胞存活率的比較（%，±s）

組別n 6 h 12 h 24 h 3 3 3 3空白組二冬膏低劑量組二冬膏中劑量組二冬膏高劑量組100.00 101.73±1.22 98.03±2.67 97.07±1.89 100.00 98.37±3.06 100.67±3.56 98.13±3.27 100.00 99.33±2.14 96.07±3.30 97.63±2.49

2.2 各組MH-S細胞分泌炎性介質水平比較 見表3。與空白組相比，LPS刺激MH-S細胞24 h后，細胞培養上清液中NO、TNF-α及IL-6的含量明顯升高（P＜0.01）。二冬膏能不同程度地降低MH-S細胞NO、TNF-α及IL-6的分泌量，并呈一定的劑量依賴關系，但各劑量間差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組MH-S細胞分泌NO、TNF-α及IL-6比較（±s）

表3 各組MH-S細胞分泌NO、TNF-α及IL-6比較（±s）

與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。下同

組 別n NO（μmol/L）TNF-α（μg/L）IL-6（μg/L）3 3 3 3 3空白組模型組二冬膏低劑量組二冬膏中劑量組二冬膏高劑量組5.67±1.72**35.07±6.75 25.50±2.90 18.20±2.84*12.23±1.40**65.63±7.11**232.43±40.89 183.33±13.84 146.60±12.73*99.07±8.30*32.57±4.52**156.20±25.60 103.77±9.76*82.17±12.09*71.93±5.26*

2.3 各組MH-S細胞中TNF-α、IL-6及AQP-1 mRNA的比較 見表4。與空白組相比，LPS刺激MH-S細胞24 h后，細胞中TNF-α和IL-6 mRNA表達量明顯升高（P＜0.01），AQP-1的表達量明顯下降（P＜0.01）。給予二冬膏含藥血清后，MH-S細胞中TNF-α和IL-6 mRNA的表達量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），而AQP-1 mRNA的表達量明顯回升（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各組MH-S細胞中TNF-α、IL-6及AQP-1 mRNA的比較（±s）

表4 各組MH-S細胞中TNF-α、IL-6及AQP-1 mRNA的比較（±s）

組別空白組模型組二冬膏低劑量組二冬膏中劑量組二冬膏高劑量組n 3 3 3 3 3 TNF-α 1.06±0.06**2.12±0.10 1.81±0.08*1.52±0.14**1.28±0.11**IL-6 1.02±0.02**2.35±0.20 1.88±0.12*1.72±0.09*1.51±0.03**AQP-1 1.90±0.12**1.02±0.03 1.23±0.07*1.49±0.04**1.65±0.10**

2.4 各組MH-S細胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1蛋白的比較 見圖1，表5。與空白組相比，LPS刺激MH-S細胞24 h后，細胞中TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白水平明顯升高（P＜0.01），AQP-1蛋白水平明顯降低（P＜0.01）。給予二冬膏中劑量含藥血清后，MH-S細胞中TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白水平明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），而AQP-1蛋白水平明顯升高（P＜0.01）。

表5 各組MH-S細胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1相對表達量的比較（±s）

表5 各組MH-S細胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1相對表達量的比較（±s）

組別空白組模型組二冬膏中劑量組n 3 3 3 TLR4 0.25±0.07**1.12±0.10 0.48±0.11**MyD88 0.16±0.05**0.91±0.19 0.46±0.10*NF-κB p65 0.07±0.02**0.49±0.12 0.25±0.04*AQP1 0.82±0.22**0.08±0.02 0.37±0.08**

圖1 各組MH-S細胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1表達

3 討 論

肺泡巨噬細胞是肺部巨噬細胞的主要組成部分，是肺組織抵御外部侵襲的第一道防線，在維持肺部免疫系統穩態過程中發揮著重要作用［6］。肺組織在受到外源性或內源性的致病因素刺激時，肺泡巨噬細胞會大量募集并分泌大量炎性介質，形成肺組織局部炎癥微環境［7］。在炎性環境下，巨噬細胞表面的Toll樣受體表達增加，激活下游相關通路，進一步促進炎性因子的分泌與釋放。近年來研究發現，肺泡巨噬細胞參與急性肺損傷、慢性阻塞性肺病、支氣管哮喘、肺纖維化等多種肺部疾病［8-12］，提示肺泡巨噬細胞在這些疾病的發生發展過程中扮演著重要的角色。

二冬膏最早載于《攝生秘剖》，是由天冬和麥冬等比例混合經水煎、濃縮與煉蜜混合的黃棕色稠厚煎膏劑，具有養陰潤肺的功效，用于治療肺陰不足引起的燥咳痰少、痰中帶血、鼻干咽痛［13］。研究發現，二冬膏能夠抑制肺腫瘤發生、肺癌細胞A549增殖、改善LPS誘導的大鼠急性肺損傷，減輕肺組織的炎性損傷［2，14-15］。NO主要由巨噬細胞中的一氧化氮合酶催化合成，NO的過度釋放會造成周圍正常細胞的損傷［16］。TNF-α和IL-6均為炎癥反應中的重要細胞因子，TNF-α能夠激活NF-κB和JNK信號通路，調節機體的炎癥反應和免疫調節的過程；IL-6能夠激活JAK2/STAT3信號通路，調節T細胞和B細胞的增生和分化，參與免疫調節，引起免疫性病理損傷［17］。本文考察二冬膏含藥血清對LPS誘導小鼠肺泡巨噬細胞MH-S的影響，結果發現二冬膏含藥血清能夠明顯抑制LPS誘導的巨噬細胞中NO、IL-6及TNF-α等炎性介質的分泌量，并能抑制IL-6及TNF-α mRNA的表達，提示二冬膏具有改善炎癥反應的作用。

Toll樣受體（TLRs）主要分布于動物體內的巨噬細胞、單核細胞及淋巴細胞等免疫細胞表面。TLRs能夠直接識別并結合病原體或其產物，引發一系列信號轉導，進而導致炎性介質的釋放［18］。TLR4是人類發現的首個TLRs蛋白，其與相應配體結合后，能進一步激活NF-κB，從而促進各種炎性因子基因表達的激活。細胞表面的TLR4受體被激活后，能與MyD88蛋白的羧基端結合，進而激活NF-κB通路，誘導IL-6及TNF-α等炎性因子的表達［19］。AQP1在維持肺部液體平衡中起到重要作用，研究發現在LPS所致的急性肺損傷中，劇烈的炎癥反應造成肺泡上皮細胞和血管內皮細胞受損使肺組織AQP1表達急劇下降。AQP1蛋白主要存在于上皮細胞和內皮細胞中，但巨噬細胞膜上AQP1的減少能夠明顯影響巨噬細胞的吞噬功能，加重炎癥反應［20］。本文研究發現，二冬膏含藥血清能夠改善由LPS導致的AQP1的下調，同時抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，進而抑制炎性因子的表達與釋放。

綜上所述，二冬膏含藥血清能夠通過上調AQP1，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，從而抑制炎性因子的表達及釋放，達到抗炎作用。