表觀遺傳修飾調控微小RNA表達在肺癌中的研究進展

胡錫麟 田凱華

1 前言

肺癌是全世界癌癥引起死亡中最常見的一種，5年生存率僅為18%。其中80%的肺癌患者由于診斷較晚而無法進行手術。在美國，每年大約有22萬人被診斷為肺癌和支氣管癌，主要誘因是吸煙[1]。近年來，第二代測序技術的進步與發展使我們在理解肺癌發展的分子機制方面取得了巨大進展。表觀遺傳模式可以在不改變DNA序列的前提下改變可見表型[2]，同時參與對基因表達的調控和維持基因組的穩定性[3,4]，因此在肺癌的發展中起著關鍵作用。這些機制不僅調控蛋白質編碼基因，而且影響蛋白質非編碼基因[2]。微小RNAs（microRNAs, miRNAs）是由發夾結構產生的小的非編碼RNA。生物信息學技術的發展與成熟促使著miRNA研究的進展，其在表觀遺傳調控、肺癌細胞生長周期的調控、細胞分化與凋亡等方面的作用正在被揭示[5-7]。表觀遺傳學調控著miRNA表達，而miRNA的異常表達可以誘導肺癌的發生、發展、侵襲、轉移。這促使了人們尋找和評估這些分子，以用于癌癥的診斷和治療。本綜述將對表觀遺傳學機制和miRNA之間的關系和在肺癌中的作用進行綜述。

2 表觀遺傳學與肺癌

遺傳和表觀遺傳改變的結合，引起基因表達和功能的失調，可能是癌癥發生的重要原因之一[8]。因此，表觀遺傳模式的改變以及遺傳異?？梢允刮覀儗δ[瘤的發生有一個更好的了解。癌癥中最著名的表觀遺傳調控是啟動子區域CpG島的異常甲基化以及組蛋白修飾中的去乙?；?甲基化改變[8]。

DNA甲基化通常是甲基與CpG島的胞嘧啶殘基和5-甲基胞嘧啶結合[9]。約60%的人類基因啟動子都能觀察到這些修飾。甲基的加成反應是由DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases, DNMTs）催化的。已知的DNMTs有3類，根據它們的底物類型和產生的功能來區分：DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。在正常細胞中，甲基化是糾正基因表達模式、細胞分化和發育的重要途徑之一[10]。然而，在腫瘤組織中，因為癌基因或抑癌基因相關的關鍵調控區受到表觀遺傳修飾，DNA甲基化的穩態可能被破壞。已經發現，腫瘤在DNA甲基化改變上表現出比正常組織更高的特異性，包括低甲基化和高甲基化[11]。低甲基化與基因組的不穩定性和印跡丟失、非整倍體以及癌基因的激活有關[12]。然而，DNA高甲基化可能因為靶基因在人類基因組中的位置的不同而發揮不同作用。在基因啟動子內的CpG豐富區，高甲基化是導致多種腫瘤中大量的抑癌基因沉默的原因[13]。DNA高甲基化誘導轉錄沉默主要有兩種機制：①甲基化的CpG島阻礙了轉錄因子與DNA序列的結合，或阻礙了抑制蛋白如組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylases, HDACs）的形成。DNA高甲基化可能引起甲基化的DNA與具有高親和力的蛋白質復合物結合成甲基結合域復合物，進而直接或間接地阻礙轉錄因子的結合，影響基因表達[14]；②甲基CpG結合蛋白，如mbd和mep2可以誘導抑制基因表達的作用[15]。而在肺癌細胞中，某些抑癌基因CpGs區域的甲基化以及正常基因組內廣泛低甲基化，可致抑癌基因沉默和染色體旋轉程度的增加，從而引起腫瘤細胞的生長[16,17]。據報道，吸煙可能會對DNA甲基化產生影響，甚至在戒煙之后的幾年內仍然有效[18]。觀察肺癌患者全血DNA樣本發現疾病相關基因存在異常的甲基化[19,20]，芳香烴受體阻遏子基因和表達凝血酶或胰蛋白酶受體3的F2R基因的低甲基化與與吸煙和肺癌風險增加有關[19]。同時，有研究[18]發現肺癌患者支氣管上皮細胞的p16和死亡相關蛋白激酶的啟動子甲基化程度較低。在吸煙者和未患肺癌的前吸煙者的支氣管上皮細胞中也存在這種異常甲基化，因此這種低甲基化可能與吸煙相關。

另一種基因表達受表觀調控的方法是組蛋白修飾，即通過改變組蛋白尾，來實現基因表達的動態調節[21]。最常見的組蛋白修飾有乙?；⒓谆⒎核鼗?、磷酸化和蔗糖化[21]。組蛋白修飾調節基因表達主要有兩種方式：①組蛋白乙酰化影響轉錄活性；②組蛋白甲基化導致染色質濃縮與失活[22]。組蛋白的乙?；鶊F在HDAC作用下能夠被消除，進而誘導基因沉默。HDAC在細胞分化、增殖和凋亡中發揮著關鍵作用[23]。同時這種消除可能與肺癌的病程進展相關，因為許多癌癥分子具有改變HDAC的活性的作用[24]。

目前以表觀遺傳學為作用靶點的藥物主要包括HDAC抑制劑、DNMT抑制劑和Janus激酶2（Janus kinase 2,JAK2）抑制劑。DNA甲基化被認為是肺癌強有力的治療靶點，其中在實驗和臨床上最廣泛使用的藥物是DNMT抑制劑，如阿扎胞苷和地西他濱[25-27]。

3 miRNA與肺癌

引起癌癥的表觀遺傳學重要因素還有非編碼RNA，這些RNA不被翻譯成蛋白質，而在轉錄水平和轉錄后水平上調節基因的表達[28,29]，并被認為是調控癌癥等疾病發生的關鍵因子，因此許多非編碼RNA被列為致癌因素或腫瘤抑制因子[30]。miRNAs是一種長度為19 nt-24 nt的單鏈非編碼RNA。它們是在1993年對秀麗桿線蟲的研究中發現的，隨后迅速地被認識到，高度保守的miRNA序列在單細胞和多細胞真核生物之間的調節途徑中起著至關重要的作用[31]。miRNAs具有調控轉錄后基因表達，促進mRNAs切割或者抑制mRNAs翻譯的作用[32,33]。正常生理下，miRNA的生物合成受到機體嚴格的控制，但是癌癥能夠解除這種控制[34]。解除對miRNA表達的控制會導致其功能的改變。過表達的miRNAs和低表達的miRNAs可能分別作為促進腫瘤發展的癌基因和抑制腫瘤發展的抑癌基因。此外，由于調控目標和生物功能的多樣性，在一種腫瘤亞型中作為癌基因的miRNA可能在另一種腫瘤亞型中起著抑制癌細胞的作用[35]。

基因缺失、表觀遺傳修飾、廣泛的轉錄抑制或生物合成功能障礙是腫瘤中成熟miRNA表達異常的主要原因。miRNA分子的表觀遺傳修飾，主要包括胞嘧啶或腺嘌呤甲基化，可影響RNA的穩定性、定位、剪接和靶向性[36]。比如，在29%的肺癌患者中發現CpG島的甲基化可以影響對miR-34a的調控[37]。在Belinsky等[38]關于小細胞肺癌的研究中，HAS-miR-137和HSA-miR-886-3P的調節也受到啟動子甲基化的影響。

有研究[39]表明裝載miRNA-126的外泌體（231-Exo）通過中斷PTEN/PI3K/AKT信號通路明顯抑制A549肺癌細胞的增殖和遷移。此外，靜脈內施用載有miRNA-126的外泌體可在小鼠中產生有效的肺歸巢效應。Zhang等[40]發現環狀RNA circFGFR1通過與癌細胞中的miR-381-3p相互作用來促進非小細胞肺癌進展和對抗基于程序性細胞死亡1（programmed death-1, PD-1）的治療。Wang等[41]發現N6-甲基腺苷誘導的miR-143-3p/VASH1軸在肺癌的腦轉移中起著關鍵作用。具體數據見表1。因此，miRNA與肺癌細胞的發生發展、轉移、治療有著密切的關系。

4 表觀遺傳學與miRNA

miRNA主要通過作為表觀遺傳機制的一部分，以蛋白質編碼基因相同的機制進行自我的表觀遺傳學修飾。表觀遺傳修飾主要包括組蛋白乙?；图谆约癿iRNA基因啟動子甲基化。Wang等[42]發現大約50%的miRNA基因與CpG島相關，這意味著它們的表達可以被DNA甲基化所調控。在人類癌癥中，CpG島的啟動子高甲基化是抑癌基因miRNA沉默的最常見原因之一[43]。miRNA在癌癥中特定的表達揭示著腫瘤特定的甲基化模式[44]。同時，miRNA的表觀遺傳學調控也揭示出表觀遺傳效應物和miRNA之間的特異性[45]。除了甲基化，用于結合甲基的CpG結合域蛋白也被發現可以調控miRNA的轉錄[44]。因此，腫瘤細胞中DNA的甲基化影響miRNA的表達，可用于確定腫瘤分類、臨床診斷、預后及治療反應。此外，組蛋白修飾也能影響miRNA的表達譜，來使抑癌基因沉默[46]。比如，組蛋白的甲基化和HDAC過表達，它們可以激活或抑制miRNA的表達[47]。這表明miRNA的表達和功能受多種因素以及表觀遺傳網絡（包括DNA甲基化和組蛋白修飾機制）的調控。此外，miRNA本身也能調節表觀遺傳修飾，從而在細胞生物學中發揮關鍵作用[48]。比如，epi-miRNAs能夠調控包括DNMTs和HDACs在內的重要表觀基因調節因子的表達，同時建立一種精確的調控反饋機制[47,49]。Wei等[50]發現miR-30家族的miR-30a-3p通過對A549細胞中的DNMT3A的作用來調節p38-MAPK通路，從而抑制肺癌的進展，這暗示著miR-30a-3p可能是治療肺癌的一種新的潛在治療策略。

5 miRNA：肺癌的診斷

肺癌的早期診斷對于改善患者預后極為重要，能大大降低患者的死亡發病（81%）[51]。肺癌患者血清或組織中的miRNA的特定表達，結合胸部CT可為早期肺癌的診斷提供幫助。Keller和同事[52]發現miR-126是用于區分非小細胞肺癌組與健康對照組較合適的miRNA。在一項涉及86例非小細胞肺癌和57例健康對照組的研究中，miR-126在腫瘤患者血漿中表達水平降低了59.09%-68.18%。同時血漿中的miR126將非小細胞肺癌與健康對照人群區分開來的敏感性和特異性分別為73%和96%[53]。Cui等[54]發現在多種癌癥中存在miR-126基因啟動子的甲基化增強，從而引起miR-126表達的降低。低表達的miR-126導致靶向調節EGFL7來抑制非小細胞肺癌細胞增殖的作用和下調VEGF來抑制肺癌細胞生長的作用減弱[55,56]。因此，miR-126的異常表達與非小細胞肺癌的發病有關。

表1 miRNA表達在肺癌中的應用Tab 1 Application of miRNA expression in lung cancer

6 miRNA：評估肺癌的預后

表觀遺傳學影響miRNA表達可作為評估癌癥復發風險的新方法，同時也是有助于指導治療決策的有用工具。miR-34家族由miR-34a、miR-34b和miR-34c組成。它們是p53網絡的一部分，在DNA損傷或致癌因素作用下，p53可誘導miR-34家族的表達。此外，在大量癌癥患者中，miR-34a的表達與p53突變和miR-34a基因啟動子區域的甲基化相關。miR-34a的表達與復發和總生存相關。低水平的miR-34a表達預示著復發的可能性較高。多變量分析也表明miR-34a是復發的獨立預后指標[57]。此外，miR-127能夠以原癌基因bcl-6為作用靶點，bcl-6的主要作用是調節DNA損傷引起的凋亡反應。當miR-127因表觀遺傳改變沉默時，bcl-6將被激活[58,59]。Tan等[58]研究發現miR-127的表達改變在腫瘤中的變異是腫瘤存活和生長的重要介質，腫瘤細胞中miR-127甲基化修飾與腫瘤的存活與分期都有獨立的聯系，預示著不良的預后。Liu等[60]利用TCGA中的公共RNA序列、DNA甲基化和miRNA序列數據，建立了肺腺癌樣品中的DNA甲基化-miRNA-基因相互作用網絡發現95個與預后相關的表觀遺傳相互作用中，25個相互作用在高甲基化水平/高miRNA表達水平（H/H）和低甲基化水平/低miRNA表達水平（L/L）之間表現出顯著差異。此外，腫瘤組織中的表觀遺傳生物標記物miR-1290、miR-196b和miR-135a的組合以及血漿中的miR-21、miR-25、miR27b和miR-326可用來預測晚期非小細胞肺癌患者鉑類化療的療效[61]。

7 miRNA：肺癌的侵襲和轉移

腫瘤細胞轉移主要是指腫瘤細胞脫離原發生長部位，在機體內遠離原發部位的器官或組織中繼續增殖生長，形成同樣性質的腫瘤。主要途徑有淋巴道轉移、血道轉移和種植性轉移。miRNA與肺癌轉移的相關機制：（1）miRNA與上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transitions,EMT）相關。上皮間質轉化是指上皮細胞失去上皮表型，轉化為間充質細胞，同時獲得間質細胞表型的一種生物學現象。在肺癌表觀遺傳學改變中，miR-34a和miR-34b/c的表達被DNA甲基化所抑制[57,62,63]，41%的原發性非小細胞肺癌和67%的原發性小細胞肺癌患者的miR-34b/c被甲基化[63,64]。在肺癌中，miR-34/p53軸通過影響Snail家族基因的表達來調控EMT[65]。Chen等[66]發現miR-148的DNA甲基化與肺癌轉移有關。非小細胞肺癌細胞miR-148b表達低于正常支氣管上皮細胞。miR-148的作用主要有：①可引起上皮相關鈣黏蛋白E表達增加，間質相關鈣黏蛋白N和波形蛋白表達減少；②調節下游TGF-信號轉導因子ROCK1，抑制細胞增殖和EMT[67]。因此，miR-148b的甲基化能促進EMT。（2）miRNA可以調節肺癌細胞信號轉導途徑，進而影響腫瘤轉移。Watanabe等[63]檢測了99例原發性非小細胞肺癌的DNA甲基化狀態，發現miRNA甲基化與組織學侵襲性和淋巴浸潤有顯著相關。其中H1975和Calu-1細胞系中的miRNA-34b被其宿主基因EGFL7的自身啟動子的DNA甲基化所沉默。在肺組織中，miRNA-34b/c在p53抑癌途徑中起重要調節作用。因此，miRNA-34b的DNA甲基化可以作為肺癌侵襲性表型的生物標志物。miRNA-148a是肺癌組織中一種常見的失調miRNA。Chen等[66]對非小細胞肺癌miR-148a表觀遺傳調控的研究發現miR-148a編碼區的高甲基化導致非小細胞肺癌中miR-148a的表達水平降低，而miRNA-148a能夠抑制DNMT1的活性。由于DNMT1對維持細胞DNA甲基化模式至關重要，這將導致甲基化敏感基因失活，包括轉移抑制蛋白（例如鈣黏蛋白E）[68,69]。在多種侵襲性癌癥中發現鈣粘蛋白E的功能喪失與轉移和侵襲相關[70]，因此，miR-148a與非小細胞肺癌的淋巴結轉移、晚期臨床分期、總生存期縮短密切有關。此外，分解DNA甲基轉移酶DNMT1和DNMT3B以及使用地西他濱來抑制DNA甲基化能夠調節對癌轉移有抑制性的14q32 miRNA的表達。在肺癌和肝轉移的臨床前模型中，甲基化依賴性14q32 miRNA的表達抑制了轉移定植，并與轉移性癌癥患者的臨床結局改善相關。這些發現暗示了DNA甲基化的表觀遺傳修飾通過miRNA網絡調節癌轉移，并揭示了地西他濱對轉移抑制性miRNA激活的作用[71]。miRNA表達的表觀遺傳學改變可以用于研究抑制肺癌轉移的潛在治療靶點，從而提高肺癌患者的生存率。

8 miRNA：肺癌的治療

對于具有癌基因或抑癌基因特點的miRNA，可通過外源性地消除或導入，來降低或提高其細胞內水平，進而達到抑制肺癌細胞生長的作用。①miRNA可與傳統抗癌藥物聯合使用。miR-29家族直接以DNMT3A/3B為作用靶點或通過Sp1以DNMT1為作用靶點，可通過Src-ID1通路在肺癌中起抗增殖和抗轉移的作用[72,73]。因此，在肺癌細胞株中，miR-29s表達具有恢復表觀遺傳修飾的正常模式和重新激活甲基化沉默的抑癌因子的作用[73]。Sacko等[74]還將染料木黃酮與miRNA-29b共包裹在混合納米粒中，因兩種分子能夠攻擊多個靶點，這種聯合治療模式具有優異的抗增殖作用；②miRNA調控可用于輔助靶向治療。已有報道說明肺癌中存在miR-124基因的甲基化[43]。miR-124a能通過調控靶基因泛素特異性蛋白酶14（ubiquitin-specific protease 14, USP14）的表達抑制肺癌干細胞的生長和自我更新，并促進其凋亡和提高吉非替尼敏感性。因此，外源的miR-124a和USP14可用于輔助非小細胞肺癌的靶向治療[75]。Wei等[50]發現miR-30家族的miR-30a-3p通過對A549細胞中DNMT3A起作用來調節p38-MAPK通路，從而抑制肺癌的進展，這表明miR-30a-3p可能是針對肺癌的一種新的潛在治療策略。

9 結論

隨著對miRNA在肺癌發生發展中的作用和分子機制研究的不斷深入，miRNA可以用于識別高危人群，區分良性腫塊和惡性腫瘤及治療。同時，miRNA不僅能夠在轉錄后水平上起調控作用，而且也是表觀遺傳機制中的調控對象。這個復雜網絡的各成分之間的異常失衡與肺癌的發生機制、轉移浸潤及治療方案有重要聯系。因此，更好地理解miRNA和表觀遺傳學的相互作用，將提高我們對肺癌發生過程的認識，在不久的將來幫助我們找到可以用來征服肺癌的有效策略。