距離-溫度聯合的新型篩選法提高人精子質量的效果分析

饒金鵬，邱 楓，蔡益婷，魏 凱，金 敏，金 帆

(浙江大學醫學院 1.附屬第二醫院 生殖醫學中心； 2.附屬婦產科醫院 生殖遺傳教育部重點實驗室， 浙江 杭州 310000)

篩選獲得高質量精子是輔助生殖(assist reproductive technology, ART)體外受精成功的關鍵之一，密度梯度離心(density gradient centrifugation, DGC)或上游(swim-up, SU)因操作簡單，并能在較短時間內將活力較好的精子從精漿、死精、白細胞、病原微生物等有害物質中分離出來，而成為廣大生殖醫學中心采用的主流方法。已有研究顯示DGC及SU處理后的運動精子在DNA完整性、細胞膜成熟度或細胞超微結構上存在一定比例的缺陷[1]，這可能影響ART的受精率，增加缺陷精子與卵子結合的風險。

人體內受精是一個自然選擇的過程。精子需從陰道開始，經過長距離的游動，先后經過宮頸、子宮和輸卵管，而當精子游至輸卵管時，由于管腔內溫度梯度的存在，使得具有熱趨向性的獲能精子定向游到壺腹部與卵子結合[2-3]。但目前絕大多數生殖醫學中心在使用DGC或SU處理完精液后，未對精子進行進一步的長距離篩選，而將溫度趨向性機制引入ART的報道也僅見于哺乳動物[4-5]。本研究通過增加獲能精子的水平游動距離，并設置溫度梯度，分析不同距離、溫度條件下精子活力、濃度、正常形態率及DNA碎片率等指標的變化，探討適宜的距離-溫度條件組合(distance-temperature-combined selection conditions)，為進一步改善ART中優質授精精子的制備提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：40%和80%梯度離心培養液(SAGE公司)；精子洗滌液Sperm Rinse、配子處理液G-GAMETE、石蠟培養油(Vitrolife公司)；人血清白蛋白(Irvine公司)；Diff-Quik精子快速染色試劑盒、精子DNA碎片檢測試劑盒(深圳博銳德生物科技有限公司)；甲醇、乙醇(杭州雙林化工試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 精液樣本：選取2019年1月至2019年9月于浙江大學醫學院附屬第二醫院男科行精液常規檢查正常的精液樣本20份(均保證取精前禁欲2～7 d)。保留部分精液原液(O組)后，將余下精液小心加到含有80%和40%密度梯度離心液的管中，300×g離心15 min，收集底部沉淀并重懸于5 mL精子洗滌液中200×g離心10 min，再用5 mL精子洗液重復洗滌一遍后將精子沉淀重懸于0.5 mL的體外配子處理液G-GAMETE中，即得到去除了精漿、白細胞等雜質的獲能精子。樣本取材經浙江大學醫學院附屬第二醫院倫理委員會審批通過(倫理審批編號：研2019-209)，患者知情并同意將樣本用于科學研究。

1.2.2 距離-溫度聯合篩選精子：選取直徑為100 mm的培養皿，用記號筆在圓皿外底面標記不同長度(2、5和8 cm)的刻度線，再用加樣器吸取恒定液體量(500 μL)的G-GAMETE培養液并沿背面刻度線加注并拉出寬度相同的條狀液滴，最后在液滴表面覆蓋石蠟油。將恒溫培養箱溫度分別設置為32 ℃和37 ℃，將裝有條狀液滴的培養皿分別放入不同溫度的培養箱內。其中，32 ℃培養箱中部分培養皿底部一側墊有37 ℃恒溫電熱片，保證皿內3條液滴的右側對齊并位于電熱片導熱區的正上方，同時使用微滴溫度檢測儀對培養皿中條狀液滴的不同區段進行溫度測定，以驗證形成32 ℃～37 ℃的溫度梯度(圖1)。培養液均需在箱中平衡4 h以上，從而形成A1(2 cm,32 ℃)、A2(5 cm,32 ℃)、A3(8 cm,32 ℃)、B1(2 cm,37 ℃)、B2(5 cm,37 ℃)、B3(8 cm,37 ℃)、C1(2 cm,32 ℃～37 ℃)、C2(5 cm,32 ℃～37 ℃)、C3(8 cm,32 ℃～37 ℃)9組不同的距離-溫度聯合篩選條件。將離心后的獲能精子分成體積相等(50 μL)的10份,留存1份作為初始樣本I組(0 cm,37 ℃)，其余9份添加到各條狀液滴的一端，孵育60 min后，從液滴的另一端收集精子樣本進行后續實驗。

The right side of three strip droplets are aligned and placed on the heating plate forming a temperature gradient圖1 距離-溫度聯合篩選法Fig 1 Distance-temperature-combined spermselection approach

1.2.3 精子濃度、活力的測定：充分混勻精液標本，取標準體積的精液置于改良Neubauer血細胞計數板上，蓋上蓋玻片，當相差顯微鏡視野中精液不再漂浮，計數并計算精子濃度[6]。對樣本進行計算機輔助精子分析(computer-aided sperm analysis，CASA)，通過前向運動(progressive motility, PR)、非前向運動(non-progressive motility, NP)及不動(immobility, IM)精子數據的讀取，評估精子的活力[6]。

1.2.4 精子形態學評價：采用Diff-Quik快速染色法評估精子選擇對形態學的影響。將10 μL精子樣本均勻涂布于潔凈的載玻片上，空氣中自然干燥后，使用固定劑(三芳基甲烷)、染液A(嗜酸性氧雜蒽)、染液B(嗜堿性硫氮雜苯)對玻片染色，流水浸洗除去多余染劑，干燥后于100×油鏡下觀察染色精子，判斷并計數正常形態精子所占的比例[6]。

1.2.5 精子DNA損傷檢測：采用精子染色質擴散試驗(sperm chromatin dispersion assay, SCD)來判斷精子優選的效果[6-7]。使用深圳博銳德精子DNA碎片檢測試劑盒，取定量精子樣本加入到預先

裝于Eppendorf管中的呈融化狀態的瓊脂糖凝膠中，混合后取30 μL制作涂片，并于4 ℃冰箱中靜置5 min， 使精子包埋于瓊脂糖微凝膠，將涂片浸入酸性反應液A(7 min)和反應液B(25 min)，再經過蒸餾水和乙醇洗脫，使精子發生酸變性并去除核蛋白，最后再經過瑞氏染色后于200×鏡下觀察精子雙鏈DNA擴散形成特征性光暈的情況，光暈寬度≤精子頭部最小直徑的1/3視為碎片化精子，最后計算DNA損傷精子百分比。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 精子濃度的比較

在溫度條件相同情況下孵育60 min，精子的濃度隨著水平游動距離的延長呈極顯著下降(P<0.01)。在距離相同的條件下，32 ℃～37 ℃溫度梯度中精子的濃度顯著性高于恒溫32 ℃或恒溫37 ℃中精子的濃度(P<0.01)，恒溫32 ℃與恒溫37 ℃中精子濃度無明顯差異(表1)。

表1 不同距離-溫度聯合篩選條件下精子濃度的比較Table 1 Comparison of sperm concentration by different distance-temperature-combined selection n=20)

2.2 精子活力的比較

在進行距離-溫度聯合篩選之前，使用密度梯度離心法處理后得到的獲能精子，其活動精子百分率(PR+NP)顯著性高于精液原液的活動精子百分率(P<0.01)。32 ℃、37 ℃、32 ℃～37 ℃條件下，隨著距離的延長，精子活力無明顯提高(圖2)。

O.original sperm sample before DGC; I.initial capacitated sperm after DGC; A1～C3.sperm samples processed by different distance-temperature selection conditions; *P<0.01 compared with group O圖2 不同距離-溫度聯合篩選條件下精子活力的比較Fig 2 Comparison of sperm motility by differentdistance- temperature-combined selection

2.3 精子形態正常率的比較

精子采用Diff-Quik法進行染色并判斷其形態是否正常(圖3A)。在進行距離-溫度聯合篩選之前，使用密度梯度離心法處理后得到的獲能精子，其正常形態率與精液原液的正常形態率相比無明顯差異。在溫度條件相同情況下，經過長距離(5、8 cm)篩選獲得的精子比初始的獲能精子(0 cm)具有更高的正常形態率(P<0.05)。在距離相同的條件下，32 ℃～37 ℃溫度梯度中精子的正常形態率略高于恒溫32 ℃或恒溫37 ℃中精子的正常形態率，但差異不明顯(圖3B)。

A.part of sperm morphology(×1 000); 1.normal; 2～8. abnormal; B.the percentage of sperm with normal morphology after different treatments; O.original sperm sample before DGC; I.initial capacitated sperm after DGC; A1～C3.sperm samples processed by different distance-temperature selection conditions; *P<0.05 compared with group I

2.4 精子DNA碎片率的比較

經SCD法檢測后含有DNA碎片的精子或DNA完整的精子(圖4A)。距離-溫度聯合篩選前，密度梯度離心法處理后得到的獲能精子，其DNA碎片率與精液原液的DNA碎片率相比無明顯差異。恒溫條件下，長距離(5、8 cm)篩選獲得的精子，其DNA碎片率略低于短距離(2 cm)以及初始獲能精子。長距離(5、8 cm)聯合32 ℃～37 ℃溫度梯度，其DNA碎片率較初始獲能精子進一步降低(P<0.05，圖4B)。

A.effect of sperm chromatin dispersion assay(×200); sperm with integrated DNA (yellow arrows) and sperm with DNA fragmentation (blue arrow); B.the percentage of sperm with DNA fragmentation after different treatments; O.original sperm sample before DGC; I.initial capacitated sperm after DGC; A1～C3.sperm samples processed by different distance-temperature selection conditions; *P<0.05 compared with group I

3 討論

本研究基于女性生殖道距離較長以及存在溫度梯度的特性，設置不同的距離、溫度條件對具有更好前向運動性及溫度趨向性的精子進行進一步優選。實驗結果顯示，經過長距離(5、8 cm)的水平游動，精子的正常形態率顯著高于初始獲能精子以及精液原液的正常形態率，原因可能在于較長的距離設置更接近女性生殖道的生理長度，從而篩選得到更高比例具有正常遷移能力的精子[8]。短距離(2 cm)條件對檢驗精子遷移能力相對有限，且隨著孵育時間的延長，一部分低質量精子會借助液體的擴散作用移動到臨近的收集區域， 故篩選效果不明顯。上游法由于加入到精液上方的培養基體積較小[9]，使精子游動的距離同樣較短，且在吸取上清的過程中存在將底部沉淀一同吸起的風險，因此其效果也不如長距離篩選。

本研究將溫度梯度設為32 ℃～37 ℃，不同于以往文獻報道的溫度梯度設置[10-11]。原因在于本研究的目的是將篩選獲得的精子用于人的體外受精，41 ℃[10]或39 ℃[11]的溫度上限設置超出了人體正常的生理溫度，而高溫會導致精子DNA、線粒體或細胞膜的損傷[12]。前期的研究顯示，只有獲能的精子具有改變其原有運動方向并朝著溫度更高區域游動的能力[2-3]。因此，本研究在使用溫度梯度篩選精子前首先使用密度梯度離心使精子獲能。實驗結果顯示，無論在2、5還是8 cm的條件下，32 ℃～37 ℃溫度梯度中精子的濃度都顯著高于恒溫32 ℃或恒溫37 ℃中精子的濃度，證實了人精子具有溫度趨向性，這與用熱分隔管獲得的結果相一致。此外，在長距離(5和8 cm)條件下， 32 ℃～37 ℃的溫度梯度使得所獲得精子的DNA碎片率顯著低于初始獲能精子的DNA碎片率。這可能是由于能夠沿著溫度梯度游過較長距離的精子，其內部由磷脂酶C和肌醇三磷酸受體Ca2+通道介導的溫度趨向性機制能正常運作[3]，而正常運作的前提是需要精子細胞具有較好的DNA完整性。

隨著距離的延長或溫度梯度的增設，精子的活力未見顯著性提高，這應該是由于傳統的密度梯度離心法在篩選獲得高活力精子方面效果明顯，使得活力進一步提升的空間受限。但隨著距離的延長，精子的濃度呈極顯著下降趨勢，這與精子體內受精的情況相一致[13]。而即使增設了溫度梯度條件，在有限時間內經過8 cm的水平距離游動，所獲得的精子密度也是極低的(0.6×105個/mL)，難以達到正常體外受精所需精子量的下限值(1.5×105個/mL)[9,14]。而(5 cm，32 ℃～37 ℃)條件下所獲得精子的活力、正常形態率、DNA碎片率與(8 cm，32 ℃～37 ℃)條件下相當，但精子密度更高(8×106個/mL)，能夠達到實施體外受精精子濃度的標準。因此，認為(5 cm，32 ℃～37 ℃)條件下優選獲得的精子，可能更適宜應用于今后體外受精的臨床實踐。較低的精子正常形態率與體外受精后較低的持續妊娠率呈顯著性相關，而精子DNA碎片率過高也會導致受精失敗、早期流產、新生兒缺陷等不良ART結局[15]。距離-溫度聯合的新型篩選法比傳統精液體外處理法能夠獲得正常形態率更高，DNA碎片率更低的精子，可降低體外受精過程中缺陷精子與卵子發生結合的風險，相信該方法的應用能夠使廣大不孕癥患者獲益。