改良保存液處理紅細胞對糖尿病小鼠創面愈合的影響

衛含偉，朱娜娜，王 歡，劉小倩，段立雙，周 循，郭建榮*

(1.皖南醫學院研究生院，安徽 蕪湖 241002； 2.海軍軍醫大學附屬公利醫院 麻醉科，上海 200135)

在所有接受外科手術的患者中，有8%～10%為糖尿病患者[1]，傷口愈合不良作為糖尿病的主要并發癥之一，已成為糖尿病患者術后恢復的關注焦點。自體輸血已成為現代醫學關注的熱點和未來醫學發展的方向，自體輸血不僅可以避免異體輸血帶來的風險和并發癥，同時也可緩解血源短缺的現狀。有研究指出自體輸血(autologous blood transfusion)可作為傷口愈合的主要治療突破[2]；所以采用適當方法處理和保存糖尿病患者的血液，保持紅細胞(red blood cell，RBC)離體后的正常形態及功能，避免因RBC貯存損傷而影響糖尿病患者的傷口愈合至關重要。缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是HIF-1轉錄因子的亞基，研究顯示HIF-1α在創面愈合過程中具有一定作用[3]，本研究主要模擬臨床自體輸血，觀察不同保存液處理后糖尿病小鼠RBC功能的改變，及其回輸后對糖尿病小鼠傷口愈合的影響，并初步探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:SPF級雄性昆明小鼠30只，體質量26～30 g (中國科學院上海實驗動物中心，SKD111001)。

1.1.2 主要試劑:ELISA試劑盒、山羊抗兔IgG抗體、兔血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、HIF-1α、Ⅰ抗、Ⅱ抗、β-肌動蛋白、MEK、p-MEK、 ERK1/2、 p-ERK1/2、PI3K、p-PI3K、 AKT 和p-AKT(Abcam公司)；ECL熒光檢測試劑盒(上海古朵生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的建立:通過連續5 d腹腔注射50 mg/kg鏈脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型。采用隨機數字表法將小鼠分為獻血組和實驗組，實驗組小鼠隨機分為標準組(standard)和改良組(improvement)。

1.2.2 血液的采集及保存:采集建模成功的獻血組小鼠全血[4]，分別用改良保存液和標準保存液放入4 ℃～6 ℃的冰箱內進行保存，保存液[5]配方主要成分有改良保存液和標準保存液。改良的血液保存液：2 mmol/L腺嘌呤、55.5 mmol/L糖、55 mmol/L甘露醇、26 mmol/L NaCl和12 mmol/L Na2HPO3，pH值為6.5。標準血液保存液：2.2 mmol/L腺嘌呤、110 mmol/L糖、70.1 mmol/L氯化鈉、20 mmol/L磷酸氫二鈉和12 mmol/L檸檬酸組成，pH值為5.8。

1.2.3 紅細胞功能的檢測:在血液保存的第7、14、21和28天，根據試劑盒的使用說明，用分光光度儀檢測微量游離血紅蛋白(free hemoglobin，fHb)，COBAS-B-123全自動血氣分析儀及電解質分析儀檢測血液樣品中P50、血pH值、RCD，ELISA檢測2,3-二磷酸甘油酸(2,3-diphosphoglycerate，2,3-DPG)含量。

1.2.4 傷口模型的建立及取材:血液保存的第7天，異氟烷麻醉，用剪刀將小鼠背部皮膚的毛發剃去、消毒，制作直徑為2 cm表皮開放傷口模型，分別輸注保存7 d的改良保存血和標準保存血，輸注后連續觀察和測量傷口，持續14 d。第14天異氟烷麻醉小鼠后，處死，收集小鼠創面皮膚組織進行后續實驗。

1.2.5 創口形態學的觀察:計算機分析數碼相機拍攝圖像，按公式計算創面愈合率。采用常規HE 染色，觀察創口的組織形態學變化。

1.2.6 免疫組織化學觀察:將切片脫蠟、水化后，滴加1%的H2O2，室溫孵育10 min，去除內源性過氧化物酶，隨后微波法抗原修復。加入兔血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF))或HIF-1α，室溫下孵育60 min，蒸餾水沖洗，置入PBS溶液中。生物標記的山羊抗兔IgG抗體(1∶3 000)37 ℃下孵育40 min，用蒸餾水沖洗，然后放置在PBS溶液中。應用DAB顯色，蘇木精輕度復染，脫水、透明、封片。

1.2.7 Masson染色觀察:切片脫蠟、水化后，蘇木精染色10 min，充分水洗，用1%的鹽酸-乙醇進行1～3 s的分化，然后用水沖洗15 min，切片放入促藍液中致切片變藍，清水沖洗，將切片放在立春紅酸性復紅液中浸泡10 min，用2%的冰醋酸溶液水洗片刻，1%的磷鉬酸溶液進行3～5 min分化，苯胺藍染色5 min后浸泡在0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，脫水、透明、封片，在光學顯微鏡下觀察并獲得圖像。

1.2.8 Western blot檢測蛋白: 皮膚組織用PBS洗滌兩次，加入裂解緩沖液，在渦流混合器中搖動，在4 ℃下、12 000 r/min離心30 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE分離，轉膜。加入Ⅰ抗，室溫孵育2 h，洗滌后加入Ⅱ抗，室溫孵育1 h。使用電化學發光法(ECL)顯示條帶， ECL熒光檢測試劑盒(BB-3501)，使用Bio-Rad圖像分析系統采集圖像，然后通過圖像J軟件進行分析。

1.3 統計學分析

2 結果

建模期間2只小鼠死亡，3只未建模成功。

2.1 儲存RBC功能

改良組血漿 fHb含量降低，P50、pH、2,3-DPG和RCD顯著升高(P<0.05)(圖1A～E)。

A.fHb content; B.P50 oxygen pressure; C.blood pH; D.level of 2, 3-DPG; E.RCD value; *P<0.05 compared with the standard group; #P< 0.05 compared with improvement (7 days)

2.2 糖尿病小鼠傷口愈合能力

與標準組比較，改良組小鼠術后第7和14天皮膚創面面積顯著下降(P<0.05)(圖2A,B)。改良組小鼠術后第14天皮膚組織和血管面積顯著增加(P<0.05)(圖2C～E)。與標準組比較，改良組小鼠皮膚膠原纖維的表達和纖維化程度在手術后14 d升高(圖2F)。

A.wound healing was observed on the 7th and 14th day after operation, with blood transfusion in which the bloods were preserved in different preservation solutions; B.quantification and statistical analysis of wound healing at 0, 1, 4, 7 and 14 days after operation; C.HE staining for wound healing of the skin tissues 14 days after operation(scale bar=25/50 μm); D.quantification and statistical analysis of wound healing granular tissue 14 days after operation; E.quantification and statistical analysis of angiosomes 14 days after operation; F.masson staining of wound healing tissues (bar = 50 μm); *P<0.05 compared with the standard group

A.in situ detection of HIF-1α by immunohistochemistry(scar bar=25 μm); B.quantification and statistical analysis of the HIF-1α expression in wound tissues; C.level of VEGF by immunohistochemistry; D.quantification and statistical analysis of level of VEGF; E.level of EGF by immunohistochemistry; F.quantification and statistical analysis of level of EGF; *P<0.05 compared with the standard group

2.3 糖尿病小鼠皮膚中HIF-1α、VEGF和EGF及HIF-1α相關蛋白的表達

與標準組比較，改良組小鼠皮膚組織中HIF-1α、VEGF和EGF水平顯著升高(P<0.05)(圖3A～F)。改良組小鼠皮膚組織中的PI3K/Akt和MEK/ERK表達增加，p-PI3K、p-AKT、p-MEK和p-ERK的蛋白表達水平均顯著高于標準組(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with the standard group圖4 兩組糖尿病小鼠HIF-1α相關蛋白表達情況

3 討論

創傷愈合是多種細胞、細胞因子及細胞外基質和可溶性介質之間相互作用和高度協調的一種組織損傷的再生反應過程，局部或全身使用促血管生成分子可以促進血管生成和傷口愈合[6]。糖尿病傷口愈合的機制比較復雜，糖尿病患者的傷口愈合障礙可能與其RBC功能異常有關[7]。RBC功能異常導致局部組織缺血缺氧，其變形能力的降低，導致RBC對中性炎性細胞浸潤、細胞外基質增生的病理生理學改變的抑制作用減弱，對糖尿病并發癥的發生亦起到了推波助瀾的作用，由此可認為改善糖尿病患者RBC形態功能，可能會促進糖尿病患者傷口愈合。

本實驗結果表明，同標準液保存RBC比較，改良血液RBC與氧的親和力增加，fHb降低，RBC變形能力增強，而且通過觀察實驗組小鼠14 d傷口愈合程度發現，輸注改良RBC小鼠傷口愈合顯著增強，證明功能改善后的RBC可促進糖尿病小鼠傷口愈合。高血糖下皮膚成纖維細胞和內皮細胞中HIF-1α水平降低是慢性傷口愈合不良的標志[8]，HIF-1α可通過激活Erk/MAPK 或PI3K/Akt 信號通路上調與傷口愈合密切相關蛋白的表達，其中包括與血管新生相關的VEGF 受體[9]，VEGF是血管生成的主要刺激因子，又可激活PI3K/Akt通路，結合VEGF受體介導血管生成[10]。高血糖能夠抑制HIF-1α的蛋白水平及其轉錄功能這一推斷已得到證實[11]，在高糖或糖尿病環境下，抑制HIF-1α的具體分子機制不清，糖尿病患者RBC的功能異?？山档虷IF-1α 水平和活性[12]。本研究中，通過改良保存液保存的血液，其RBC功能顯著改善，改良組創口皮膚組織中HIF-1α、VEGF、EGF的表達水平顯著提高，HIF-1α通路有關的蛋白表達水平也顯著提高。因此可以認為改良保存RBC可能通過改善RBC的功能，激活HIF-1α通路促進傷口愈合，但是本實驗只涉及到小鼠體內實驗，且未對小鼠HIF-1α基因沉默對照進行實驗研究，仍需要進一步實驗進行驗證。

綜上所述，改良保存液可顯著改善紅細胞的攜氧量及維持其變形性，進而促進糖尿病小鼠傷口的愈合，其機制可能與激活HIF-1α信號通路有關。