長鏈非編碼RNA TINCR通過miR-7調控肝癌細胞系Huh7侵襲和遷移

田小星，秦溧嬪，李 茜

(重慶市第五人民醫院 感染性疾病科, 重慶 400062)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)的侵襲和遷移與細胞內異常表達的基因調控有關，這些基因通過復雜的調控網絡影響肝癌細胞向遠端轉移[1]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)最初被認為是轉錄“噪音”，人們認為其在生命進程中沒有調控功能，隨著研究不斷深入，人們逐漸發現lncRNA不僅參與正常生理過程，還與疾病的發生有關[2]。在心血管系統疾病以及惡性腫瘤等常見疾病中均發現lncRNA異常表達，lncRNA也逐漸成為靶向治療疾病的潛在靶點[3]。lncRNA 組織分化誘導非蛋白編碼RNA(tissue differentiation inducing non-protein coding RNA,TINCR)參與腫瘤進展，在不同的腫瘤組織中的作用不同，TINCR在前列腺癌等腫瘤中發揮抑制作用，而在非小細胞肺癌等腫瘤中發揮促進作用[4-5]。研究報道顯示，TINCR在肝癌組織中的表達水平高于正常癌旁組織，并且TINCR高表達與肝癌患者的預后、淋巴結轉移等有關[6]。前期的預實驗發現TINCR與miR-7有互補結合位點。miR-7是一個在肝癌中表達下調的腫瘤抑制因子，可以抑制肝癌細胞的侵襲和遷移[7]。本次實驗探討TINCR對肝癌細胞遷移和侵襲的影響和靶向調控機制，為靶向基因治療肝癌提供資料，為研究肝癌轉移分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

正常肝細胞L-02和肝癌細胞系HCC9204、Huh7、SNU449(ATCC公司)；引物(金斯瑞生物科技股份有限公司)；PrimeScript RT Master Mix試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]；shRNA control、TINCR shRNA(湖南豐暉生物科技有限公司)；MMP-9抗體(Affinity Biosciences公司)；miR-7 mimics、mimics control、inhibitor control、miR-7 inhibitor(上海正茂生物科技有限公司)；MMP-2抗體(北京義翹神州科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR測定肝癌細胞中TINCR表達變化:收集對數期的正常肝細胞L-02和肝癌細胞HCC9204、Huh7、SNU449，在細胞中添加Trizol裂解試劑，提取細胞總RNA，RNA溶解在DEPC水中，以紫外分光光度計檢測A260/A280。cDNA合成用PrimeScript RT Master Mix試劑盒，反轉錄體系為：1 μL的RT Enzyme Mix Ⅰ、4 μL的5×PrimeCSript RT、1 μL的Oligo dT Primer、1 μL的Random 6 mers、2 μL的RNA，添加RNase Free-H2O補足20 μL；反轉錄條件為：37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ進行real-time PCR，PCR體系為：0.8 μL的forward和reverse primer、2 μL的cDNA、10 μL的Premix Ex Taq Ⅱ、0.4 μL的ROX Reference DyeII，添加RNase free-H2O補足20 μL；PCR反應條件為：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環。按照2-△△Ct法計算目的基因表達水平。內參基因為GAPDH。引物：TINCR 上游引物： 5′-GCTGAGGTGACGGTCTCAAA-3′，下游引物：5′-GCCTCCCAGTTTCATGGACA-3′。

1.2.2 細胞轉染和下調效果測定:將肝癌Huh7細胞分成對照、sh-NC、sh-TINCR組，sh-NC、sh-TINCR組細胞分別為用Lipofectamine 2000轉染試劑轉染shRNA control、TINCR shRNA的Huh7細胞。轉染具體步驟按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明進行。取培養24 h以后的對照、sh-NC、sh-TINCR組細胞，用real-time PCR方法測定TINCR表達變化，步驟同1.2.1。

1.2.3 CCK-8法測定肝癌細胞增殖:將3組細胞接種到96孔板中，每個孔中添加4 000個細胞、100 μL細胞培養液，將細胞板放在37 ℃的培養箱中培養24 h，將上清吸棄。然后在細胞中添加CCK-8工作液10 μL和100 μL的新鮮細胞培養液。避光反應2 h以后，用全自動酶標儀測定每個孔的A值，檢測波長調整為450 nm。

1.2.4 Transwell小室測定肝癌細胞遷移和侵襲:取出在-20 ℃保存的Matrigel，吸取600 μL的不含血清的細胞培養液添加到100 μL的Matrigel中。在放入24孔板中的Transwell小室中添加40 μL的Matrigel稀釋液，放在37 ℃孵育30 min將小室濕化。Control、sh-NC、sh-TINCR組共3組細胞用不含血清的細胞培養液懸浮，吸取100 μL添加到小室的上室中，然后在下室中添加500 μL的含血清的細胞培養液，放在37 ℃的培養箱中培養24 h。以冰預冷的4%多聚甲醛溶液固定30 min，然后用0.1%的結晶紫染色10 min。在400×顯微鏡下隨機選取6個視野，計數細胞侵襲數目，結果取均值。細胞遷移實驗前不用Matrigel濕化小室，其余步驟與侵襲實驗相同。

1.2.5 Western blot測定肝癌細胞中MMP-9和MMP-2蛋白表達:收集對數期的對照、sh-NC、sh-TINCR組共3組細胞，提取細胞總蛋白。在細胞蛋白中加入1/2體積的上樣緩沖液充分混合煮沸5 min。SDS-PAGE凝膠電泳蛋白上樣量為30 μg，在濃縮膠中使用80V電壓電泳至溴酚藍染料進入分離膠，然后調整到100 V電壓電泳至溴酚藍染料進入凝膠底部邊緣1 cm處。取出凝膠，在4 ℃環境下把蛋白電轉移到NC膜上，轉膜電流設置為200 mA恒流。取出NC膜，放在封閉液(含有5%脫脂奶粉的TBST)中，于室溫環境下結合1.5 h；然后放在一抗稀釋液(用封閉液按照1∶1 000稀釋)中，于4 ℃條件下孵育過夜；最后將NC膜放在二抗稀釋液(用封閉液按照1∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗)中，在室溫環境中孵育1.5 h。按照ECL顯色試劑盒顯色。Image J軟件分析條帶的灰度值，GAPDH作為內參，分析目的蛋白相對表達量變化。

1.2.6 TINCR靶向關系預測以及鑒定:在線生物學軟件targetscan分析TINCR的靶基因，miR-7可能為TINCR的靶基因。構建突變以后的TINCR熒光素酶報告載體(MUT)和沒有突變的TINCR熒光素酶報告載體(WT)，將MUT和WT分別同miR-7 mimics、mimics control共轉染到Huh7細胞中，培養24 h以后，檢測細胞熒光素酶活性變化，檢測步驟同熒光素酶活性檢測試劑盒。

1.2.7 Real-time PCR方法檢測肝癌細胞中miR-7表達:收集對數期的對照、sh-NC、sh-TINCR組共3組細胞，提取細胞總RNA，按照1.2中real-time PCR方法測定miR-7表達變化，內參設置為U6。引物：miR-7 上游引物：5′-TAACACTGTCTGGTAACGAT GT-3′，下游引物： 5′-CCAGTGCAGGGTCCG-3′。

1.2.8 檢測miR-7 inhibitor對下調TINCR的肝癌細胞增殖、侵襲和遷移影響:在肝癌Huh7細胞中分別共轉染TINCR shRNA、inhibitor control和TINCR shRNA、miR-7 inhibitor，命名為sh-TINCR+Anti-NC、sh-TINCR+Anti-miR-7組，CCK-8法測定增殖(步驟參照1.2.3)，Transwell小室法測定遷移和侵襲(步驟參照1.2.4)，Western blot測定MMP-2和MMP-9蛋白表達(步驟參照1.2.5)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 TINCR在肝癌細胞中的表達水平高于正常肝細胞

肝癌細胞中TINCR mRNA表達水平高于正常肝細胞(P<0.05)。肝癌Huh7細胞中TINCR表達水平最高(表1)。

表1 TINCR在正常肝細胞L-02和肝癌HCC9204、 Huh7、SNU449細胞中的表達水平

2.2 TINCR shRNA可明顯下調肝癌Huh7細胞中TINCR表達水平

Huh7細胞中轉染TINCR shRNA以后，細胞中TINCR表達水平明顯低于轉染shRNA control后的細胞(P<0.05)。TINCR shRNA可明顯下調Huh7細胞中TINCR表達水平(表2)。

表2 TINCR shRNA轉染以后肝癌Huh7細胞中 TINCR mRNA的表達水平

2.3 下調TINCR可明顯降低Huh7細胞增殖、侵襲和遷移能力

Huh7細胞中轉染TINCR shRNA以后，細胞A值、遷移數目、侵襲數目和MMP-9、MMP-2蛋白表達量均明顯低于轉染shRNA control后的細胞(P<0.05)。下調TINCR可明顯抑制肝癌Huh7細胞增殖、侵襲和遷移能力(圖1,表3)。

表3 TINCR shRNA轉染以后肝癌Huh7細胞的A值、遷移數目、侵襲數目以及MMP-9、MMP-2蛋白表達量

圖1 Western blot檢測TINCR shRNA轉染以后肝癌 Huh7細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達Fig 1 Western blot detection of MMP-2 and MMP-9protein expression in liver cancer Huh7 cellsafter TINCR shRNA transfection

2.4 TINCR靶向調控miR-7

TINCR和miR-7有互補結合位點，并且肝癌Huh7細胞中共轉染miR-7 mimics和TINCR-WT以后，細胞熒光素酶活性明顯低于共轉染mimics control和TINCR-WT的細胞(P<0.05)。TINCR靶向調控miR-7(圖2，表4)。

圖2 生物信息學軟件預測TINCR和miR-7結合位點Fig 2 Bioinformatics software predicts TINCR andmiR-7 binding sites

表4 WT和MUT轉染以后肝癌Huh7細胞熒光素 酶活性

2.5 下調TINCR可明顯促進肝癌Huh7細胞中miR-7表達

肝癌Huh7細胞中轉染TINCR shRNA以后，細胞中miR-7表達水平明顯高于轉染shRNA control后的細胞(P<0.05)。下調TINCR可明顯促進肝癌Huh7細胞中miR-7表達(表5)。

表5 TINCR shRNA轉染以后肝癌Huh7細胞中 miR-7表達水平

2.6 miR-7 inhibitor可明顯促進下調TINCR的肝癌Huh7細胞增殖、侵襲和遷移

與共轉染inhibitor control和TINCR shRNA的肝癌Huh7細胞比較，共轉染miR-7 inhibitor和TINCR shRNA后的細胞A值、遷移數目、侵襲數目和MMP-2、MMP-9蛋白水平均升高(P<0.05)。miR-7 inhibitor可明顯促進下調TINCR的肝癌Huh7細胞增殖、侵襲和遷移(圖3,表6)。

表6 miR-7 inhibitor和TINCR shRNA轉染后肝癌Huh7細胞A值、遷移數目、侵襲數目和MMP-2、 MMP-9蛋白以及miR-7表達水平

3 討論

真核生物的絕大多數基因組都會被轉錄，轉錄過程中常常產生沒有翻譯功能的lncRNA，lncRNA主要是由RNA聚合酶II轉錄形成的，具有調控DNA甲基化、染色質重塑、蛋白質修飾以及影響基因轉錄等功能，lncRNA作用方式和調控機制多樣，在人體的不同生理進程中扮演不同的角色[8]。TINCR具有促進細胞增殖的作用，其參與腫瘤發生，并且在不同的腫瘤中的研究報道不同[4-5]。TINCR在肺癌中表達上調，并且其高表達與腫瘤患者的臨床病理特征有關，下調TINCR表達可以抑制腫瘤細胞的惡性轉移潛能[5]。TINCR在前列腺癌中扮演腫瘤抑制因子的作用，其可以抑制腫瘤轉移[4]。TINCR在肝癌中高表達，TINCR可能是肝癌進展的促進因子[6]。實驗表明，TINCR在肝癌細胞中的表達水平高于正常肝細胞，并且下調TINCR可以抑制肝癌細胞增殖，這與上述研究結果相符合，均說明TINCR在肝癌進展中可能發揮促進作用。

基質金屬蛋白酶是存在于人體內的細胞外基質降解酶，其可以將細胞外基質降解而促進細胞的運動[9]。在腫瘤轉移過程中，腫瘤細胞從原來的位置脫落，并隨著血管或淋巴管進入新的組織和器官，通過惡性增殖形成轉移灶[10]。腫瘤細胞合成的基質金屬蛋白酶是腫瘤轉移的基礎[11]。MMP-2和MMP-9二者均是基質金屬蛋白酶家族成員，也是目前發現的與腫瘤轉移關系最為密切的基質金屬蛋白酶[12]。實驗表明，下調TINCR后的肝癌細胞侵襲和遷移能力下降，細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平也降低，提示TINCR在肝癌轉移中可能發揮促進作用，靶向抑制TINCR可能是抑制肝癌惡性進展的途徑。

現階段對于lncRNA作用機制研究發現，lncRNA可以通過靶向調控下游基因的表達發揮不同的生物學作用，并且lncRNA在不同的組織以及病理進程中的靶向調控作用可能不同[13]。本次實驗發現，TINCR靶向調控肝癌細胞系中miR-7的表達。miR-7是一個在肝癌組織中表達下調的miRNA分子，過表達miR-7可以抑制肝癌細胞系的侵襲和遷移[7]。本次實驗發現，TINCR靶向調控肝癌細胞系中miR-7的表達，并且下調miR-7可以逆轉下調TINCR對肝癌細胞侵襲和遷移的抑制作用，這充分證明下調TINCR抑制肝癌細胞侵襲和遷移與靶向調控miR-7有關。

總而言之，下調TINCR抑制肝癌細胞惡性增殖和轉移潛能，其作用機制與靶向調控miR-7有關，目前對于其下游的具體調節機制還不清楚，靶向抑制TINCR表達可能是抑制肝癌進展和轉移的有效途徑。本實驗結果為研究TINCR在腫瘤進展中的調控網絡提供了參考，為明確肝癌分子發生機制奠定了基礎。