倪安妮，梁清洋，姚鴻飛，李根亮*，唐玉蓮

(右江民族醫學院 1.基礎醫學院 生化教研室； 2.臨床醫學院 骨科， 廣西 百色 533000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上第6大最常見的癌，也是第3大癌死亡原因[1]。花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝過程在腫瘤發生中起著關鍵作用[2]。環氧化酶P450途徑(epoxygenase P450 pathway，EPP)是AA的一種代謝途徑，環氧化酶P450蛋白及mRNA表達水平與癌細胞表達水平正相關[3]。環氧化酶P450主要在內質網膜或線粒體膜與特定的磷脂結合，這些膜由磷脂雙分子層組成，可通過產生脂質微區影響環氧化酶P450的功能[4]。環氧化酶P450的活性中心是含有鐵卟啉結構的血紅素，活性中心的鐵離子傳遞電子在環氧化酶P450參與生命活動的氧化還原反應中發揮重要作用[5]。因此內質網膜上氧化酶P450的鐵離子結合(iron ion bonding，IIB)對EPP的作用、對AA代謝，及對癌的發生產生影響。然而，在HCC微環境中花生四烯酸(AA)代謝中內質網膜相關基因的功能還未見報道。本研究應用小鼠HCC模型，采用RNA-seq和生物信息學分析花生四烯酸(AA)代謝相關內質網膜基因在HCC微環境中的表達情況及參與AA代謝的差異表達內質網膜基因(AA metabolism differentially expressed endoplasmic reticulum genes，ADEGs)的功能，并用RT-qPCR驗證內質ADEGs的表達情況，并通過HCC微環境中ADEGs位點多態性分析其與基因表達的可能相關性。研究結果對理解HCC的發生機制具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：潔凈級6周雌雄各半昆明小鼠100只，體質量(30±5)g[長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK(湘)2019-0014]。

1.1.2 實驗試劑和耗材：H22細胞系(小鼠肝癌細胞系)(南京凱基生物科技有限公司)；RNA提取試劑盒(Invitrogen 公司)；Cyp2b9、Cyp2c39、Gpx8、Gapdh引物(上海生工生物工程股份有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：細胞系H22在1640培養基常規培養48 h后通過細胞計數儀檢測活細胞密度達到105～106個/10 μL，按細胞原液：0.9%氯化鈉溶液=1∶1至1∶10稀釋，放置室溫無菌條件下待用。隨機選取100只昆明小鼠，每只用配好的細胞懸液1×106～3×106個/0.1 mL在層流柜中腋下注射成瘤，飼養4周后，取腫瘤組織和癌旁組織。

1.2.2 RNA提取和測序：兩組(n=40)樣本組織各取50 μg，RNA質量檢測、反轉錄、文庫構建及測序數據的處理按常規程序進行。

1.2.3 花生四烯酸(AA)相關差異基因(DEGs)的篩選：通過DAVID 6.8在線軟件搜索AA代謝信號通路中所有基因，與測序數據中的DEGs比較，篩選出兩樣本中內質網膜相關的AA代謝相關基因。

1.2.4 AA相關DEGs的功能富集分析：采用DAVID 6.8在線軟件進行功能富集，分析其功能。

1.2.5 AA相關DEGs編碼蛋白的互作網絡分析：采用STRING 11.0在線軟件對內ADEGs編碼的蛋白進行蛋白共表達網絡互作分析，分析其分布和功能相關性。

1.2.6 RT-qPCR驗證AA相關DEGs的轉錄情況：隨機選擇了3個ADEGs(Cyp2b9、Cyp2c39、Gpx8)，內參基因為GAPDH，進行RT-qPCR。兩樣本分別用RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉錄試劑盒構建cDNA。qPCR檢測用熒光定量PCR試劑盒，設置程序：三步法PCR程序，預變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 10 s；退火60 ℃ 20 s；延伸72 ℃ 15 s；循環40次。溶解曲線反應程序，72 ℃～95 ℃，升溫2.05 ℃/s，恒定溫度95 ℃持續15 s；95 ℃～60 ℃，升溫-1.71 ℃/s，恒定溫度60 ℃持續60 s；60 ℃～95 ℃，升溫0.05 ℃，恒定95 ℃持續15 s。用2-ΔΔCt計算結果，驗證其表達量以及RNA-seq測序結果。

1.2.7 AA相關DEGs的AS(選擇性剪切)和SNV(單核苷酸位點變異)/INDEL(插入和缺失)與基因表達的相關性分析：利用Excel軟件對兩樣本中ADEGs中出現的頻率倍數不小于2的AS和SNV/INDEL進行統計學相關分析，如果兩樣本間發生AS和SNV/INDEL頻率倍數不小于2且0

1.3 統計學分析

基因表達以每百萬測序堿基中每千個轉錄子測序堿基中所包含的測序片斷數(expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced，FPKM)比值≥2或≤0.5，且錯誤發現率(false discovery rate，FDR)≤0.05的基因為DEGs。使用Excel軟件對ADEGs在兩樣本間發生頻率數不小于2的AS和SNV/INDEL與DEGs進行統計學相關分析。

2 結果

2.1 RNA-seq測序

兩組樣本總RNA送公司測序，分別獲得了5.01G base(35.28M clean reads)和5.02G base(35.32M clean reads)的數據。兩樣本所得clean reads數據與基因組的匹配率分別為93.65%和89.20%，且兩樣本測序數據的Q20皆大于 99%，測序數據質量較高。

2.2 AA代謝相關DEGs篩選和功能富集分析

DAVID 6.8搜索AA代謝信號通路相關基因89個，與測序數據比對，共獲得了35個AA代謝相關DEGs，14個上調，21個下調(FPKM≥2或≤0.5, FDR≤0.05)。在腫瘤微環境到肝癌發生上調表達14個基因分別為Lta4h、Cyp4f18、Ltc4s、Gpx5、Gpx8、Cyp4f18、pla2g5、Cyp2j9、Cyp2c55、Alox15、Ptgs2、Ptg2s3、ptges、Cbr2；下調表達基因分別為Cpy2c29、Cpy4a10、Cpy4a12a、Cpy2c38、Cpy2c44、Cpy2c37、Cpy2c70、Cpy2c68、Cpy4f14、Cpy2b9、Cpy2j5、Cpy4a31、Cpy2e1、Cpy4a14、Cpy2c39、Cpy2c54、Cpy2c50、Cpy2j6、Ephx2、Pla2g12b、Cbr1經功能富集分析，共得到2個BPs(生物學程序)，5個CCs(細胞組分)，9個MFs(分子功能)，1個US(蛋白位點序列特征)和6個KPs(信號通路)(圖1)。

進一步對ADEGs富集結果分析發現，這35個DEGs中Cyp2c68、Cyp2c29、Cyp4f14、Cyp2b9、Cyp2j5、Cyp4a10、Cyp2c55、Cyp4a14等參與內質網膜中的IIB，Cyp2c29、Cyp2c68、Cyp2e1、Cyp2c44、Cyp2c39、Cyp2c55、Cyp4f18等參與EPP，其中Cyp2c29、Cyp2c38、Cyp2c55、Cyp2c39、Cyp2c54、Cyp2c37、Cyp2c70、Cyp2c50等一同參與內質網膜中IIB影響EPP。

2.3 AA相關DEGs編碼蛋白的互作網絡分析

ADEGs編碼共表達蛋白的互作網絡關系分析，發現11個DEGs編碼蛋白相關性較強(圖2)。

圖2 ADEGs編碼蛋白的互作網絡關系Fig 2 Interaction network relationship of ADEGscoding proteins

2.4 AA相關DEGs的RT-qPCR驗證

隨機選取3個ADEGs進行RT-qPCR，內參基因為Gapdh。數據結果表明，其結果與RNA-seq結果一致(圖3)。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequence of RT-qPCR

2.5 AA相關DEGs的AS和SNV/INDEL與基因表達的相關性

對ADEGs的可變剪切事件(AS)、單核苷酸變異(SNV)/插入缺失標記(INDEL)分析，結果顯示：均未發現AS。SNV和INDEL分析則顯示，HCC腫瘤組織中共有21個DEGs發生了86個SNV和5個INDEL位點的改變。這些基因位點的改變主要發生在基因的4個部位，即外顯子區(exonic)、內含子區(intronic)、基因間區(intergenic)和基因上游區(upstream)，其中共有13個基因的SNV改變和1個基因的INDEL改變具有統計學意義(P<0.05)且13個基因的SNV改變和其中1個基因的INDEL改變與其基因的表達呈正相關(表2)。基因位點多態性分析結果還顯示，有8個ADEGs在HCC腫瘤組織中出現43個SNV和2個INDEL，而癌旁組織中則沒有出現這些SNV/INDEL(表3)。

BP.biological procedure; CC.cell component; MF.molecular function; KP.signaling pathways; US.protein site sequence characteristics

表2 SNV/INDEL與基因表達的相關性Table 2 Correlation between SNV/INDEL and gene expression

表3 HCC腫瘤組織中ADEGs的SNV/INDEL的發生情況Table 3 Occurrence of SNV/INDEL of ADEGs in HCC tumor tissues

3 討論

AA及其代謝產物參與各種組織的炎性反應和腫瘤的發生發展[6]。對HCC腫瘤及HCC微環境中AA代謝相關基因RNA-seq分析顯示，其中有35個DEGs，富集分析DEGs顯示基因功能集中在內質網膜中IIB對EPP的影響。在IIB的21個DEGs中有18個基因在HCC中下調表達，3個上調表達。EPP的14個DEGs中有12個基因在HCC中下調表達，2個上調表達。這些基因可與Cbr1、Alox15、Gpx8、Cbr2、Ptgs2一起參與氧化還原過程。這些基因中Cyp2c29、Cyp2b9、Cyp2c70、Cyp2j6等15個也屬于內質網膜相關差異基因。以上基因中有22種即Cyp2b9、Cyp2c38、Cyp2c44、Cyp2c70、Cyp2c50、Cyp2j6等，還參與血紅素結合，這些基因大部分都下調表達，表明從HCC的癌旁組織到腫瘤發生過程中，參與血紅素結合的蛋白質組分可能表達量減少，又由于血紅素是環氧化酶P450的活性中心，從而使其與正常的環氧化酶P450功能有差異。

GO分析結果還表明，這些基因中的17種：Cyp2c29、Cyp2b9、Cyp2c38、Cyp2c44、Cyp2c70、Cyp2c50、Cyp2j6等還參與花生四烯酸環氧酶活性。KP分析表明，AA代謝相關差異表達基因也參與以上 GO功能相關的6個信號通路，還參與GO相關的1個蛋白位點序列特征。這些結果表明，在 HCC中，大量AA相關的DEGs異常表達主要集中在EPP。而且，IIB的異常在改變EPP中發揮著極其重要的作用。蛋白互作分析也說明了這些基因功能的相關性。

SNV/INDEL結果表明，SNV/INDEL引起的基因多態性在 HCC中扮演著調控基因表達的重要功能。另外，研究結果還顯示，HCC 中下調及上調表達在ADEGs的IIB相關DEGs中多具有SNV現象，這些基因突變后則會影響EPP功能。

綜上所述，在HCC中共獲得了35個ADEGs。功能主要集中在內質網膜中IIB對EPP的影響。在ADEGs中IIB相關的DEGs涉及的許多相關基因都有廣泛的 SNV 現象，因此提示，IIB在 HCC 微環境的內質網膜中可通過自身的基因多態性突變引起EPP異常對AA代謝產生影響實現腫瘤的發生，在癌細胞的增殖過程中發揮重要作用，SNV 可能是一些基因上調及下調表達的重要調控因素。