miR-1908抑制高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞系HRECs凋亡

周麗萍，毛曉春，李 琴

(襄陽市中心醫院 眼科， 湖北 襄陽 441000)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的主要并發癥之一，嚴重時可導致失明，極大地影響患者身心健康[1]。目前，DR的發病機制尚不十分清楚，并且無確切有效的治療方法，探討DR的發病機制并尋找安全有效的治療方法具有重要意義。高血糖能夠加速細胞凋亡引起視網膜缺血、壞死，新生血管釋放產生新生血管[2]。DR與高血糖引起的生理、生化改變造成的毛細血管損傷有關[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約為22～25個核苷酸的小分子單鏈RNA，其與血管性疾病、新生血管的形成等關系密切[4-6]。微小RNA芯片檢測發現高糖環境下人視網膜血管內皮細胞(human retinalendothelial cells，HRECs)中miR-1908表達下調[7]，但miR-1908對高糖誘導的HRECs細胞凋亡的影響及其機制還不清楚。本研究主要探討了miR-1908對高糖誘導的HRECs細胞凋亡的影響及作用機制，以期為闡明DR發病機制及分子治療靶點的選擇提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗試劑

人視網膜血管內皮細胞系(human retinalendothelial cells，HRECs)(ATCC細胞庫)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和DMEM培養基( Gibco公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogen公司)；miR-1908模擬物(mimics)及模擬陰性對照物、整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)的小干擾RNA(基爾頓生物科技上海有限公司)；Trizol試劑(Tiangen公司)；反轉錄試劑盒和PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(北京寶賽生物技術有限公司)；RIPA裂解液和BCA蛋白測定試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；PAGE膜(Bio-RAD公司)；ILK抗體(Santa Cruz公司)；B淋巴細胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydro-genase，GAPDH)抗體(CST公司)；辣根過氧化酶標記的IgG(北京中山生物技術有限公司)；ECL化學發光試劑(上海翊圣生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養及分組處理：復蘇HRECs細胞，加入含10% FBS的DMEM培養基(含5.5 mmol/L葡萄糖)，置于37 ℃、5% CO2、97%濕度的培養箱中培養。根據細胞增殖狀況，每2～3 d換液1次。待細胞匯合至80%～90%時，加入0.25%胰蛋白酶消化，進行傳代培養。取對數增殖期的5～10代細胞用于實驗。參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明，分別將miR-1908 mimics(miR-1908組)、模擬陰性對照物(miR-NC組)、miR-1908 抑制劑(anti-miR-1908組)、抑制劑陰性對照(anti-NC組)、ILK的小干擾RNA(si-ILK組)、亂序無意義陰性序列(si-NC組)、miR-1908 mimics與ILK過表達載體(miR-1908 +pcDNA3.1-ILK)、miR-1908 mimics與空載體(miR-1908 +pcDNA3.1組)轉染至HRECs細胞。將HRECs細胞分為8組：1)對照組：正常培養(5.5 mmol/L葡萄糖)；2)高糖組：25 mmol/L[8]葡萄糖干預HRECs細胞；3)高糖+ miR-NC組：25 mmol/L葡萄糖干預miR-NC組細胞24 h；4)高糖+ miR-1908組：25 mmol/L葡萄糖干預轉染miR-1908組細胞24 h；5)高糖+ si-NC組：25 mmol/L葡萄糖干預 si-NC組24 h；6)高糖+ si-ILK組：25 mmol/L葡萄糖干預si-ILK組細胞24 h；7)高糖+ miR-1908+pcDNA3.1組：25 mmol/L葡萄糖干預miR-1908+pcDNA3.1組細胞24 h；8)高糖+ miR-1908+pcDNA3.1-ILK組：25 mmol/L葡萄糖干預miR-1908+pcDNA3.1-ILK組細胞24 h。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-1908表達水平：使用Trizol試劑提取HRECs細胞中總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度。參照反轉錄試劑盒操作說明，將RNA反轉錄為cDNA，并以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環。以U6為內參，采用2-△△Ct法計算miR-1908的相對表達水平。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡：各組HRECs細胞培養后用胰蛋白酶消化，PBS溶液清洗后，加入100 μL緩沖液，輕輕吹打重懸細胞。然后加入10 μL的Annexin-V-FITC，室溫避光孵育20 min。再加入5 μL的PI，混合均勻，室溫避光孵育15 min。最后加入500 μL緩沖液，用流式細胞儀檢測。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達：使用RIPA裂解液提取細胞中總蛋白，置于冰上充分裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液即為蛋白。BCA法測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，分離后轉移至PAGE膜，使用5 %脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別加入ILK(稀釋度1∶150)、Bcl-2(稀釋度1∶500)、Bax(稀釋度1∶500)和GAPDH(稀釋度1∶500)抗體，4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的IgG，室溫孵育2 h。TBST洗膜后，加入ECL化學發光試劑，避光顯影，凝膠成像系統曝光拍照。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因實驗：應用生物信息學軟件預測ILK的3′UTR含有miR-1908的互補序列。用PCR擴增兩者結合位點的片段，將該片段插入pMIR-REPORT熒光素酶載體中，構建ILK野生型質粒(WT-ILK)，并使用點突變技術對結合位點進行突變，構建 ILK突變型質粒(MUT-ILK)。將miR-NC與WT-ILK(miR-NC+WT-ILK組)、miR-1908與WT-ILK(miR-1908+WT-ILK組)、miR-NC與MUT-ILK(miR-NC+MUT-ILK組)、miR-1908與MUT-ILK(miR-1908+MUT-ILK組)共轉染至HRECs細胞，轉染48 h后，收集細胞，參照雙熒光素酶報告基因試劑盒操作說明，檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-1908在高糖作用的HRECs細胞中的表達水平

與低糖組比，高糖組HRECs細胞中miR-1908的表達水平顯著降低(圖1)(P<0.05)。

*P<0.05 compared with LG group圖1 高糖對HRECs細胞中 miR-1908表達的影響Fig 1 Effect of high glucose on the expression ofmiR-1908 in HRECs cells

2.2 過表達miR-1908對高糖作用的HRECs細胞凋亡的影響

與高糖+ miR-NC組比，高糖+ miR-1908組HRECs細胞中miR-1908表達水平和Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，HRECs細胞凋亡率和Bax蛋白表達水平顯著降低(圖2，表1)(P<0.05)。

表1 過表達miR-1908對高糖作用的HRECs細胞凋亡率的影響

2.3 miR-1908靶向調控ILK表達

ILK的3′UTR含有miR-1908的互補序列(圖3A)。miR-1908可降低ILK野生型3′UTR的熒光素酶活性(表2)(P<0.05)。與miR-NC組比，miR-1908組HRECs細胞中ILK蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比，anti-miR-1908組HRECs細胞中ILK蛋白表達水平顯著升高(圖3B，表3)(P<0.05)。

A.flow cytometry; B,C.effect of over-expression of microRNA-1908 on apoptotic protein expression of HRECs induced by high glucose; *P<0.05 compared with HG and miR-NC group

表2 雙熒光素酶報告實驗

A.ILK’s 3′UTR contained complementary sequences of miR-1908; B.miR-1908 regulated the expression of ILK圖3 miR-1908靶向、調控ILKFig 3 miR-1908 targeted and regulated ILK

表3 miR-1908調控ILK的表達

2.4 抑制ILK表達對高糖作用的HRECs細胞凋亡的影響

與高糖+ si-NC組比，高糖+ si-ILK組HRECs細胞中ILK和Bax蛋白表達水平、細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(圖4)(P<0.05)。

2.5 過表達ILK能逆轉miR-1908對高糖作用的HRECs細胞凋亡的影響

與高糖+miR-1908+pcDNA3.1組比，高糖+ miR-1908+pcDNA3.1-ILK組HRECs細胞中ILK和Bax蛋白表達水平、細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(圖5)(P<0.05)。

3 討論

DR是糖尿病最常見的微血管并發癥，高血糖是導致糖尿病并發癥發生和發展的重要因素之一[9]。高血糖環境可引起細胞代謝發生變化，異常凋亡引起器官功能紊亂。目前，DR發生和發展的病理機制尚未十分清楚。探討影響高糖誘導的HRECs細胞凋亡的分子機制，有助于闡明該疾病的發病機制，并尋找有效的治療靶點。

miRNA參與細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等各種生物學行為，在疾病的發生和發展過程中發揮重要作用[10]。miR-1908在非小細胞肺癌細胞中低表達，過表達miR-1908可抑制其增殖，是非小細胞肺癌的治療靶點[11]。miR-1908在膠質瘤組織中表達上調， 上調miR-1908表達促進膠質瘤U251細胞的增殖和侵襲能力[12]，說明miR-1908在不同疾病中發揮的作用不同。目前，miR-1908對高糖誘導的HRECs細胞凋亡的影響還未見報道。本研究結果顯示，高糖誘導可促進HRECs細胞miR-1908的表達，提示miR-1908可能參與糖尿病視網膜病變的發生和發展。本研究結果顯示，過表達miR-1908能夠降低高糖誘導的HRECs細胞凋亡率，并上調HRECs細胞中Bcl-2蛋白表達，下調Bax蛋白表達，提示miR-1908可能通過調控Bcl-2和Bax蛋白表達抑制高糖誘導的HRECs細胞凋亡，更詳盡的調控機制有待深入探討。

A,B.effect of inhibiting ilk expression on apoptotic protein expression of hrecs induced by high glucose; C.effect of inhibiting ilk expression on apoptotic rate of hrecs induced by high glucose; *P<0.05 compared with HG+si-NC group

A,B.over-expression of ILK can reverse miR-1908 on apoptotic protein expression of HRECs induced by high glucose; C.overe-xpression of ILK can reverse the apoptosis rate of HRECs induced by miR-1908; *P<0.05 compared with HG+miR-NC group; #P<0.05 compared with HG +miR-1908+pcDNA3.1 group

miRNA通過與靶mRNA互不配對在轉錄后水平調控靶基因的表達，參與各種疾病的發生和發展[13-14]。為了進一步探討miR-1908影響高糖誘導的HRECs細胞凋亡的分子機制，本研究首先利用TargetScan生物信息學軟件預測顯示，整合素連接激酶(ILK)的3′UTR含有miR-1908的互補序列，提示miR-1908可能調控ILK表達。雙熒光素酶報告基因結果證實了miR-1908可與ILK的3′UTR靶向結合。同時上調miR-1908表達HRECs細胞中ILK蛋白表達降低，而下調miR-1908表達HRECs細胞中ILK蛋白表達升高，進一步說明miR-1908靶向負調控ILK表達。

ILK是一種高度保守的蛋白，通過介導細胞與細胞外基質的跨膜信號傳導，參與調節細胞增殖、凋亡和分化等生物學行為。作為一種多功能調節因子，ILK參與糖尿病視網膜病變的發生和發展[15]。本研究結果顯示，抑制ILK可能通過上調HRECs細胞Bcl-2蛋白表達并下調Bax表達，抑制了高糖誘導的HRECs細胞凋亡。此外，過表達ILK部分逆轉了過表達miR-1908對高糖誘導的HRECs細胞凋亡及對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響，提示miR-1908可能通過靶向負調控ILK表達，上調Bcl-2蛋白表達并下調Bax表達抑制高糖誘導的HRECs細胞凋亡，是DR疾病的潛在治療靶點。

綜上所述，miR-1908參與調控HRECs細胞凋亡，其作用機制可能與負調控ILK影響Bcl-2和Bax蛋白表達有關，是糖尿病視網膜病變治療的潛在分子靶點。