微生物源谷氨酰胺轉氨酶對干貝嫩化作用的研究

王飛飛，王徐媛，楊仁迪，潘童，傅玲琳，2，王彥波，2，*

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310018；2.浙江工商大學浙江食品質量安全工程研究院，浙江杭州310018）

干貝，是由扇貝的后閉殼肌脫水干制而成，別名瑤柱、馬甲柱，甲帶子等。干貝營養豐富，富含蛋白質、礦物質，且脂肪含量較低，風味獨特，不僅腥味大減，還具有干貝特有的肉香味，是國際公認的高檔水產品，被列入八珍之一，具有重要的使用價值和經濟價值[1]。但干貝質地較硬，咀嚼性能較差，軟化處理繁瑣耗時，一定程度上影響其市場推廣。

谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TG）是一種催化酰基轉移的酶，能促進限制性氨基酸的引入，蛋白質交聯以及蛋白質等電點和溶解性的改變[2]。相較于動植物來源，微生物源谷氨酰胺轉氨酶（microbial transglutaminase，MTG）因其更容易生產，且具有較優的酶學特性，如反應最適pH值范圍廣、熱穩定性強、酶活性不依賴Ca2+、受酶抑制劑和金屬離子的影響小、底物特異性低等優點[3-4]，被廣泛應用于促進肉制品的黏結、乳制品的乳化[5-7]。但其在干貝的肉質嫩化研究上，至今鮮有報道。

本研究通過測定質構特性，蒸煮損失，可溶性蛋白含量以及感官評價研究茂源鏈霉菌源谷氨酰胺轉氨酶處理的各個因素對干貝嫩度的影響，通過響應面試驗確定最優嫩化條件，為干貝嫩化工藝提供試驗參數，對提高干貝食用品質及商業價值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干貝：福建莆田海鮮批發中心，每粒質量為1.5 g～3 g，置于4℃冷藏備用；谷氨酰胺轉氨酶（食品級）（200 000 U/g，產自茂源鏈霉菌）：東恒華道生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、五水硫酸銅、碘化鉀、四水合酒石酸鉀鈉：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸：國藥集團藥業有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：天津灝洋華科生物科技有限公司；牛血清白蛋白：生工生物工程上海有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AB135-S型電子天平、DELTA 320型pH計：瑞士METTLER TOLEDO公司；DHG-9143BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱：上海新苗公司；Milli-Q超純水裝置：美國MILLIPORE公司；CT3質構儀：美國BROOKFIELD公司；AZ8852溫度計：臺灣衡欣公司；WI1102型旋渦振蕩器：中國東西儀科技有限公司；HH系列-1型數顯恒溫水浴鍋：中國聚創環保公司；DL-1-15萬用電爐：中國泰斯特公司；Spectra Max i3型酶標儀：美國MOLECULAR DEVICES公司；Allegra X-3012臺式冷凍高速離心機：美國BECKMAN COULTER公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗

將干貝清洗干凈，挑選大小均勻且質量為（3±0.2）g的干貝，每3粒干貝為一個試驗樣本，每個樣本質量（9±0.5）g。

配置pH 6.0的磷酸緩沖液，將其置于50℃的電熱鼓風干燥箱備用。用pH 6.0，溫度為50℃的磷酸緩沖液配置濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的谷氨酰胺轉氨酶溶液。將干貝浸沒在酶溶液中20 min，期間控制環境溫度為50℃。將酶處理后的干貝置于真空蒸煮袋中，沸水浴10 min。隨后，進行質構分析。

用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉調節磷酸緩沖液分別為 pH 值為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，分別溶解得到0.6%谷氨酰胺轉氨酶溶液，并控制溫度為50℃。將干貝浸沒在酶溶液中20 min，期間控制環境溫度為50℃。酶處理完成后，將干貝置于真空蒸煮袋中，沸水浴10 min。隨后，進行質構分析。

配置 pH6.0 的磷酸緩沖液，將其置于 40、50、60、70、80℃的環境中。將干貝浸沒在0.6%酶溶液中20 min。酶處理完成后，將干貝置于真空蒸煮袋中，沸水浴10 min。隨后，進行質構分析。

1.3.2 響應面試驗

基于單因素試驗的結果，固定嫩化時間為20 min，沸水浴時間為10 min，利用Design-Expert.8.05進行三因素三水平的Box-Behnken試驗設計。選取的3個因素為酶用量、pH值和溫度，對應的響應指標為彈性。Box-Behnken試驗設計的因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素及水平表Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of the optimization parameters used in Box-Behnken experimental design

1.3.3 感官評價

參照國標GB/T 12310-2012《感官分析方法成對比較檢驗》[8]中規定的感官評價——成對比較檢驗流程，運用定向成對比較檢驗方法，對嫩化后的干貝進行感官分析。邀請30位具有一定感官品評經驗的試驗人員組成品評小組，把試驗組和對照組的干貝樣品記編號330和550，并按照330、550的順序隨機呈遞給15位品評員，同時按550、330的順序呈遞給另外15名品評員。并要求品評員對干貝的硬度和彈性做差異性評價。

1.3.4 蒸煮損失

用電子天平分別稱量試驗組和對照組的干貝質量，記為M1，隨后將樣品分別放入真空蒸煮袋中，沸水浴40 min[9]。取出后用濾紙吸干表面水分后，稱取蒸煮后的質量記為M2。每組平行3次。蒸煮損失率的計算公式如下：

蒸煮損失率/%=（M1-M2）/M1×100

1.3.5 可溶性蛋白含量測定

可溶性蛋白含量是評價肉嫩度的重要指標[10-11]。在周丹等[12]的測定方法基礎上稍作修改，取嫩化后的（9±0.5）g干貝剪碎，并加入PBS緩沖液50 mL，用均質機將干貝絞碎，攪拌均勻后倒入50 mL離心管中，在4℃下離心30 min，轉速為8 500 r/min。離心后取上清液 1 mL，并加入雙縮脲試劑（CuSO4·5H2O 4 g，KI 4.4 g，KOH 28 g，酒石酸鉀鈉 13.4 g）4 mL，在 25℃室溫下避光放置20 min。取200 μL置于96孔板中。利用酶標儀測定波長為540nm處，樣品的吸光度值，記為A540nm。每組平行測 3 次。以 0、2、4、5、6、8、10 mg/mL 牛血清白蛋白標準液制作標準曲線，得回歸方程為y=0.025 6x+0.071 2，R2=0.999 6。

1.3.6 質構分析

用濾紙吸干酶處理后的干貝表面水分，通過CT3質構儀對其進行彈性和咀嚼性的測定。質構分析條件參數[13]如下：探頭類型：TA10；預測試速度：2.0 mm/s；測試速度：1 mm/s；探頭回程速度：1 mm/s；測試距離：6 mm；觸發力：1 g；數據采集速率：100.0 points/s。

1.3.7 數據統計與分析

結果取6次平行試驗的平均值，以平均值±標準差表示，采用 Origin 8.1、GraphPad Prism 7.00、Design-Expert 8.0.6和SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，差異顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶用量對質構特性的影響

酶用量對干貝質構特性的影響見圖1。

圖1 酶用量對干貝質構特性的影響Fig.1 Effects of different enzyme doses on the texture properties of scallops

由圖1可知，當加酶量濃度低于0.8%時，隨著谷氨酰胺轉氨酶濃度的增加，咀嚼性不斷降低，彈性不斷增強，當加酶量達到0.8%時，彈性增加約20%，咀嚼性降低25%，接著干貝彈性和咀嚼性趨于穩定。結果表明，添加酶的最適濃度在0.6%～0.8%之間。由于谷氨酰胺轉氨酶能夠催化肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基與受體之間進行酰基轉移，加強蛋白質交聯，改善蛋白質溶解性從而影響干貝的咀嚼性和彈性[14-15]，因此在底物蛋白充足時，隨著谷氨酰胺轉氨酶濃度的增加，干貝嫩化效果提升明顯，隨后嫩化效果隨著底物逐漸交聯最終達到平衡。

2.1.2 pH值對質構特性的影響

pH值對干貝質構特性的影響見圖2。

圖2 pH值對干貝質構特性的影響Fig.2 Effects of pH value on the texture properties of scallops

如圖2所示，隨著pH值的增加，干貝的咀嚼性逐漸減小后增大，彈性逐漸增大后減小。當pH值達到7時，彈性達到最大，增加43%，咀嚼性達到最小，降低20%。結果表明，谷氨酰胺轉氨酶嫩化干貝的最適pH值為7，這符合茂源鏈霉菌源谷氨酰胺轉氨酶的最適 pH 6～7 的性質[16-18]。

2.1.3 溫度對嫩化效果的影響

溫度對干貝質構特性的影響見圖3。

圖3 溫度對干貝質構特性的影響Fig.3 Effects of temperature on texture properties of scallops

由圖3可知，當溫度在30℃～60℃之間時，干貝彈性逐漸增大，咀嚼性逐漸減小，當溫度高于60℃時，干貝的彈性和咀嚼性則分別減弱和增強。結果表明，酶處理的最適溫度為60℃。該結果與孫高軍等[19]對谷氨酰胺轉氨酶最適作用溫度的探究結果基本一致。這是因為溫度的適度升高能促進谷氨酰胺轉氨酶活性位點—催化三聯體“Cys64-His255-Asp274”的暴露，但溫度過高會造成谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TG）以及干貝本身所含有的蛋白質不同程度的變性，因而影響嫩化效果[20-22]。

2.2 響應面試驗結果

以谷氨酰胺轉氨酶用量（X1）、pH 值（X2）、溫度（X3）為試驗因素，對應的響應指標為彈性，進行三因素三水平的Box-Behnken試驗。

響應面試驗水平及結果見表2。

表2 響應面試驗水平及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

利用Design-Expert.8.05對試驗數據進行方程的回歸擬合，得到結果如下：Y=-0.028X1+0.15X2-0.038X3-0.042X1X2-0.05X1X3+0.18X2X3-0.27X12-0.28X22-0.22 X32+4.90

回歸方程的各因素方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variances of the developed regression model

續表3 回歸模型方差分析Continue table 3 Analysis of variances of the developed regression model

如表3所示，該模型的P＜0.05，說明該回歸模型顯著。失擬項P值為0.137 1，說明相對于絕對誤差該模型不顯著。并且，相關系數R2=0.846 9，表明該回歸模型與數據的擬合度較高，即預測的準確度也相應較高。其中，模型的 X2、X12、X22、X32的 P＜0.05，說明這幾項對于彈性增強的影響極為顯著。但X1酶用量，X3溫度，交互項X1X2，X1X3，X2X3對于該回歸模型影響不顯著。

各因素交互關系的響應曲面及等高線見圖4。

圖4 各因素交互關系的響應曲面及等高線圖Fig.4 Response surface and contour map of interaction of various factors

由圖4A可知，固定酶用量，pH值在5到7的范圍內變化時，彈性變化較為明顯，先增大后減小。與之相比，彈性強度隨加酶量增加強度變化較小。結果表明，相同條件下pH值對于干貝嫩化的作用強于酶用量。等高線圖表征兩者的交互作用。如圖4B所示，改變相同的彈性強度，酶用量與pH值改變量基本相等，即兩者的交互作用并不明顯。方差分析中X1X2對應的P值為0.658 8＞0.05，兩者交互作用不顯著，兩項分析結果一致。由圖4C可知，當溫度確定時，pH值的立體圖整體趨勢更陡，且單因素方差分析結果顯示pH值的顯著性（P=0.049 3）大于酶用量（P=0.676 6）。此外，方差分析結果顯示X2X3所對應的P值為0.05＜0.093 6＜0.1，且圖D等高線圖呈現橢圓形，說明pH值與酶用量之間存在一定的交互作用。由圖4E可知，溫度與pH值的立體圖整體趨勢較為平緩，表明溫度，pH值這兩個因素對于彈性大小的影響皆不顯著。相比之下，溫度對應的曲面更為陡峭，即溫度的影響略大。圖4F的等高線圖雖呈橢圓形，但其離心率接近1，即兩個因素的交互作用不明顯。綜上，3個因素對于彈性的影響從大到小依次為：pH值＞溫度＞酶用量。

根據多元二次函數，3個因素的一階偏導數?X1、?X2、?X3，進而求得響應值的最優值以及此時對應的X1、X2、X3。軟件模擬得出，當 X1為 0.58%，X2為 6.29，X3為50.42℃時，彈性值達到最大，為4.92 mm。在這個最優條件下，做驗證試驗，得到干貝實際彈性值為（4.91±0.41）mm，與預測值4.92 mm相符。

2.3 嫩化作用驗證試驗結果

2.3.1 成對比較結果分析

干貝感官差異性結果見圖5。

圖5 干貝感官差異性結果圖Fig.5 The sensory results of scallop samples

如圖5所示，有25名認為330樣品（試驗組）彈性更強，有21名認為550（對照組）硬度更大。參考國標GB12310-2012《感官分析 成對比較檢驗》，當品評人數為30人，P=0.05時，其中一項被選擇多于20次，說明兩個測試樣品之間有明顯差異。結果表明，經微生物源谷氨酰胺轉氨酶（microbial transglutaminase，MTG）在最優條件下嫩化后的干貝與未經任何處理干貝在彈性和硬度上能明顯被消費者感知出差異，說明MTG酶的作用能較好地改善產品的感官品質。

2.3.2 理化指標的差異性分析

理化指標差異性結果見圖6。

圖6 理化指標差異性結果圖Fig.6 The physical and chemical results of MTG treated samples

MTG酶的添加有效降低了干貝的蒸煮損失，減少了可溶性蛋白含量，減小咀嚼所需的力度，同時增強了干貝的彈性，嫩化效果顯著。這是因為谷氨酰胺轉氨酶能夠催化酰基轉移，促進分子之間的共價鍵形成，進而增強了氨基酸之間的交聯，使得游離在溶質中的蛋白質含量降低，蒸煮損失減少[23-24]。Afshari R等[25]學者在探究MTG對小麥蛋白的作用機理時也得到了相應的結論。再者，蛋白質的交聯能夠促進體系形成致密的三維結構，類似于面制品中的面筋網絡，能夠改善整個體系的質構特性，包括彈性和咀嚼性。此外，在響應面試驗得到的最優條件下對干貝進行酶處理，實際得到的干貝彈性值為（4.91±0.41）mm，與預測結果4.92 mm基本一致，再次證明回歸模型的科學性和可靠性。

3 結論

本研究基于酶用量、pH值、處理溫度3個因素，利用Box-Behnken試驗設計基于彈性指標優化得到微生物源谷氨酰胺轉氨酶最佳作用條件為：酶用量0.58%，pH 6.29，溫度50.41℃。控制酶用量0.58%，pH 6.29，溫度50.4℃，進行酶處理驗證試驗，與未經處理的干貝相比，感官品質存在顯著差異，同時彈性提高19%，咀嚼性降低27%，蒸煮損失減少68%，可溶性蛋白含量增加38%，干貝的感官品質得到了明顯的改善。本研究為干貝嫩化工藝提供參數，并為微生物源谷氨酰胺轉氨酶在海產品中的應用提供技術支持。