響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取辣木葉多糖工藝

張世奇，楊娟，惠永海，孫勁毅，*

（1.嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東湛江524048；2.廣東省辣木資源開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，廣東湛江524048）

辣木（Moringa oleifera），又稱鼓槌樹，為辣木科辣木屬多年生植物，是印度北部喜馬拉雅山南麓的速生樹種，其根、莖、葉、種子既可作為蔬菜食用，又極具藥用價值，有“奇跡樹”之稱[1-2]。辣木各部位中，尤以辣木葉的應(yīng)用最為廣泛[3]。在食用價值方面，辣木葉富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、氨基酸等多種營養(yǎng)成分，其中鈣和蛋白質(zhì)的含量分別是牛奶的4倍和2倍，維生素C的含量是柳橙的7倍，葉酸的含量是豬肝的4.7倍，因此許多地區(qū)用辣木葉來改善兒童營養(yǎng)不良的問題或?qū)⒗蹦救~作為補品為孕婦及哺乳期母親增加母乳[4-6]；在藥用價值方面，辣木葉中含有豐富的多糖、酚類、黃酮和植物甾醇等多種生物活性成分，因此在降血脂[7]、抗癌[8]、抗氧化[9]、抗菌消炎[10]等方面均有顯著效果。

辣木葉多糖是優(yōu)質(zhì)植物源多糖之一，其含量在8.61%～33.61%[11-13]。研究表明，辣木葉多糖具有促進腸胃吸收[14]、增強免疫力[15]、調(diào)節(jié)血糖[16]等功效。植物多糖常用的提取方法主要有水提法[17]、酸堿提法[18]和酶提法[19]等。但上述提取方法存在提取效率低、大量酸堿對環(huán)境造成污染和多糖提取后涉及溶劑殘留等問題。因此本研究采用超聲輔助水熱法提取辣木葉多糖，利用超聲波產(chǎn)生的機械效應(yīng)和空化效應(yīng)等物理作用破壞植物細胞壁，加快多糖溶出并增加多糖溶出率；同時以水作為提取溶劑又兼具環(huán)境友好和多糖無溶劑殘留等優(yōu)點，最后采用響應(yīng)面法優(yōu)化辣木葉多糖提取工藝，以期為辣木葉多糖的后續(xù)研究提供相應(yīng)的試驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木葉：湛江市佳池塘辣木種植基地；無水乙醇、葡萄糖、苯酚（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋（SHA-CD-1000）：金壇市順華儀器有限公司；電子分析天平（AUY120）：日本島津公司；高速冷凍醫(yī)用離心機（JW-3021HR）：安徽嘉文儀器裝備有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9035A）：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗機（DL-360E）：上海之信儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-2000B）：上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式真空泵（SHZ-D3）：鞏義市英峪儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 辣木葉多糖提取工藝

將新采摘的辣木葉洗凈后自然晾干，粉碎過100目篩，準(zhǔn)確稱取5.000 g辣木葉干粉，按照試驗設(shè)計條件進行超聲提取，將提取液以6 000 r/min離心15 min，取上清液在60℃下減壓濃縮至50 mL，向濃縮液中加入250 mL無水乙醇，待沉淀完全后，6 000 r/min離心15 min，收集沉淀并將其35℃干燥3 h，得到辣木葉多糖成品。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。吸取0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于10 mL比色管中，加水至1 mL，加入1 mL 5%苯酚和5 mL濃硫酸，搖勻后沸水浴反應(yīng)15 min，以蒸餾水為空白對照，在490 nm處測定溶液吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程為y=3.512x+0.061，R2=0.995 4，表明在 0.01 mg/mL～0.1 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)，吸光度和葡萄糖濃度的線性關(guān)系良好。

1.3.3 辣木葉多糖得率計算

將辣木葉多糖成品配制成一定濃度的溶液，按照1.3.2的方法測定溶液的吸光度，并計算出溶液中多糖的濃度，按照如下公式計算辣木葉多糖得率：

式中：C為辣木葉多糖的溶液濃度，mg/mL；V為辣木葉多糖溶液的體積，mL；M為辣木葉干粉的質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗

按照1.3.1的提取工藝，每個樣品提取兩次，研究料液比[1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）]、提取時間（20、30、40、50、60 min）、提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、超聲功率（40、60、80、100、120 W）對辣木葉多糖得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以辣木葉多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗方案見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response test

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復(fù)3次，試驗數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，其中單因素試驗結(jié)果使用SPSS 25.0進行分析，并用Origin 9.0繪制曲線圖；響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)運用Design-Expert8.05分析并繪制響應(yīng)面圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對辣木葉多糖得率的影響

利用SPSS統(tǒng)計分析，以5個料液比每組3個平行試驗作因子，多糖得率為評價指標(biāo)進行單因素方差分析，結(jié)果見表2。

表2 料液比方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis of material-liquid ratio

由表2可知，P=0.000＜0.05，說明當(dāng)其余條件固定時，料液比對辣木葉多糖得率的影響顯著；多重比較檢驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 料液比對辣木葉多糖得率的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the polysaccharide yield in Moringa oleifera leaf

由圖1可知，隨著提取溶劑的增加，辣木葉多糖得率呈先增大后減小的趨勢。提取溶劑較少時，多糖不能充分溶解，因此提取率較低；料液比為1∶25（g/mL）多糖得率最大，此時多糖的得率為6.54%；提取溶劑用量繼續(xù)增加時，多糖得率下降，這可能是由于提取溶劑較多時雜質(zhì)溶出干擾了多糖溶出[21]。

2.1.2 提取時間對辣木葉多糖得率的影響

利用SPSS統(tǒng)計分析，以5個提取時間每組3個平行試驗作因子，多糖得率為評價指標(biāo)進行單因素方差分析，結(jié)果見表3。

表3 提取時間方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of extraction time

由表3可知，P=0.000＜0.05，說明當(dāng)其余條件固定時，提取時間對辣木葉多糖得率的影響顯著；多重比較檢驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時間對辣木葉多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the polysaccharide yield in Moringa oleifera leaf

如圖2所示，當(dāng)提取時間為40 min，辣木葉多糖的得率最大為6.51%。隨著提取時間的增加，多糖得率先上升后下降。這是因為隨著時間增加，細胞壁的破碎度和破碎機率增加，多糖更容易析出。但當(dāng)提取時間繼續(xù)增加時，多糖的得率下降，這可能是由于提取時間過長時，多糖在超聲波的作用下降解速度加快，導(dǎo)致多糖得率快速降低[22]。

2.1.3 提取溫度對辣木葉多糖得率的影響

利用SPSS統(tǒng)計分析，以5個提取溫度每組3個平行試驗作因子，多糖得率為評價指標(biāo)進行單因素方差分析，結(jié)果見表4，多重比較檢驗結(jié)果見圖3。

表4 提取溫度方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis of extraction temperature

圖3 提取溫度對辣木葉多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the polysaccharide yield in Moringa oleifera leaf

由表4可知，P=0.000＜0.05，說明當(dāng)其余條件固定時，提取溫度對辣木葉多糖得率的影響顯著；多重比較檢驗結(jié)果如圖3。

如圖3所示，當(dāng)提取溫度小于80℃時，多糖得率隨溫度增加而增加，當(dāng)提取溫度為80℃時，多糖得率達到最大，此時多糖得率為7.24%。當(dāng)提取溫度達到90℃時，多糖得率下降，這是因為當(dāng)提取溫度過高時，雜質(zhì)的溶出率增加同時多糖分子結(jié)構(gòu)被高溫破壞，最終導(dǎo)致多糖得率下降[23]。

2.1.4 超聲功率對辣木多糖得率的影響

利用SPSS統(tǒng)計分析軟件，以5個超聲功率每組3個平行試驗作因子，多糖得率為評價指標(biāo)進行單因素方差分析，結(jié)果見表5。

表5 超聲功率方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis of ultrasound power

由表5可知，P=0.000＜0.05，說明當(dāng)其余條件固定時，超聲功率對辣木葉多糖得率的影響顯著；多重比較檢驗結(jié)果如圖4。

圖4 超聲功率對辣木葉多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound power on the polysaccharide yield in Moringa oleifera leaf

由圖4可知，辣木葉多糖得率隨超聲功率的增加呈現(xiàn)先遞增后減小的趨勢，當(dāng)超聲功率為100 W時，多糖的得率為7.22%，此時多糖的得率最大。但當(dāng)超聲功率繼續(xù)增加時，多糖的得率反而降低，這是由于當(dāng)超聲功率較大時，超聲波的空化作用加劇了分子之間的摩擦，導(dǎo)致多糖分子中的化學(xué)鍵斷裂而引起多糖降解，使多糖得率降低[24]。

2.2 辣木葉多糖提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 回歸方程的建立與顯著性分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果如表6所示。以料液比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）、超聲功率（D）為自變量，辣木葉多糖得率（Y）為響應(yīng)值，運用Design-Expert8.05進行擬合得到二次多項回歸方程：Y=7.30+0.12A+0.081B+0.20C+0.54D-5.000×10-3AB-0.025AC-0.23AD+0.018BC-0.045BD+0.19CD-0.92A2-0.15B2-0.42C2-1.19D2。

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Experimental arrangement and results of response surface methodology

回歸模型的方差分析見表7。

表7 回歸模型的方差分析Table 7 The variance analysis of regression model

續(xù)表7 回歸模型的方差分析Continue table 7 The variance analysis of regression model

由表7可知，模型P＜0.000 1，表明該回歸模型差異極顯著；失擬項P＞0.05，不顯著；R2=0.991 5，RAdj2=0.983 1，說明該試驗的結(jié)果與預(yù)測值接近，因此試驗的可信度和精密度較高，該模型的擬合程度較高。就單因素而言，超聲功率、提取溫度及料液比的P＜0.01，影響極顯著，而提取時間的P＜0.05，影響顯著。由F值可知，在試驗范圍內(nèi)各因素對辣木葉多糖得率的影響依次是D（超聲功率）＞C（提取溫度）＞A（料液比）＞B（提取時間）。

2.2.2 各因素的交互作用分析

各因素之間交互作用的響應(yīng)面圖見圖5。

圖5 各因素之間交互作用的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface for the effects of experimental factors

圖5表明，料液比、提取溫度和超聲功率的交互作用較顯著，其余各因素之間的交互作用不顯著。其中料液比和超聲功率交互的響應(yīng)面最陡峭，因此二者的交互作用最顯著，多糖得率的最大值在料液比1∶25（g/mL）、超聲功率100 W附近。提取溫度與超聲功率的交互的響應(yīng)面較陡峭，二者存在明顯的交互作用，在超聲功率100 W、提取溫度79.97℃附近，多糖得率有最大值。結(jié)合顯著性分析結(jié)果可知，在提取辣木葉多糖的過程中，應(yīng)更加精確的控制超聲功率、提取溫度及料液比，以確保工藝的穩(wěn)定性。

根據(jù)回歸模型和響應(yīng)面結(jié)果進行分析，辣木葉多糖最佳提取工藝為：料液比1∶25.12（g/mL）、提取時間42.52 min、提取溫度83.05℃、超聲功率104.86 W，在此條件下，預(yù)測辣木葉多糖的得率為7.41%。

2.3 提取工藝的驗證

考慮實際操作，將條件優(yōu)化為：料液比1∶25（g/mL）、提取時間43 min、提取溫度83℃、超聲功率105 W，在最優(yōu)條件下，根據(jù)回歸模型計算得到的辣木葉多糖得率為7.39%，實際得率為7.36%，二者僅相差0.03%，因此利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化辣木葉多糖的提取工藝準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面分析可知，各因素對辣木葉多糖得率的影響依次為超聲功率＞提取溫度＞料液比＞提取時間，且當(dāng)各因素交互作用時，料液比和超聲功率、提取溫度和超聲功率影響顯著。經(jīng)過響應(yīng)面法優(yōu)化后得到辣木葉多糖的最佳提取工藝為料液比1∶25（g/mL）、提取時間43 min、提取溫度83℃、超聲功率105 W，辣木葉多糖實際得率為7.36%。超聲波輔助技術(shù)應(yīng)用于辣木葉多糖的提取，既能夠高效獲得多糖，又能避免酸堿類提取劑的使用，同時也為后續(xù)多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生理活性等研究提供良好的試驗基礎(chǔ)。