復(fù)合酶制備檸檬膳食纖維工藝條件優(yōu)化

劉義武，韓鵬，黃輝，*，王碧

（1.內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641199；2.果類(lèi)廢棄物資源化省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川內(nèi)江641199）

在飛速發(fā)展的今天，人們對(duì)功能食品的需求迅速增加。在功能食品配方中，膳食纖維具有多種功能和高度適用性，成為食品工業(yè)中的一種重要成分。膳食纖維（dietary fiber，DF）[1-3]是指聚合度（monomeric units，MU）大于2且不能夠被人體小腸內(nèi)源酶水解也不能被小腸吸收的碳水化合物，包括三類(lèi)：（1）天然存在于水果、蔬菜和谷物等食物中的非淀粉多糖，或食物原料經(jīng)化學(xué)、物理或酶法提取或合成的非淀粉多糖（聚合度大于 9）；（2）聚合度在 3～9 的抗性低聚糖；（3）聚合度大于9的抗性淀粉；經(jīng)化學(xué)、物理或酶法提取或合成的聚合物必須證明其對(duì)健康有益的科學(xué)證據(jù)才是膳食纖維。DF具有降低食物胃腸通過(guò)時(shí)間、增加糞便量、降低血總膽固醇、降低餐后血糖等功效，有利于降低肥胖、糖尿病和高血壓的發(fā)病率，被譽(yù)為人體必需的“第七大營(yíng)養(yǎng)素”[2-8]。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的正常成年人膳食纖維攝入量為25 g/d，而統(tǒng)計(jì)表明，中國(guó)人實(shí)際攝入量?jī)H約一半[1-2]。全球膳食纖維市場(chǎng)2014年為24.7億美元，預(yù)計(jì)膳食纖維市場(chǎng)將以復(fù)合年增長(zhǎng)率13.4%的速度高速增長(zhǎng)，2020年達(dá)53.2億美元[2，9]。因此，膳食纖維已經(jīng)成為食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

膳食纖維按水溶性分為可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）兩類(lèi)，分別具有不同生理功能[2]。IDF與SDF比例直接決定DF生理功能。SDF含量超過(guò)總膳食纖維（total dietary fibre，TDF）30%（或 SDF/IDF在 0.43～1）有利于充分發(fā)揮其生理功能[9-11]。與谷物膳食纖維相比，柑橘類(lèi)膳食纖維除SDF含量高外，還具有較強(qiáng)的抗氧化能力和抑菌等功能（由含量豐富的類(lèi)黃酮等物質(zhì)提供），已廣泛應(yīng)用于食品保鮮與功能食品研發(fā)等領(lǐng)域[12-14]。檸檬膳食纖維自由基的清除能力、總抗氧化能力強(qiáng)[15-18]。檸檬膳食纖維的膨脹、保水和保油性能均明顯高于其它水果[19]。此外，檸檬膳食纖維中SDF含量接近30%，略微改性就可得到SDF含量超過(guò)30%的膳食纖維。酶法制備膳食纖維不但反應(yīng)條件溫和，而且可以降低IDF的含量，增加SDF含量。因此，采用復(fù)合酶法制備檸檬膳食纖維，研究木瓜蛋白酶與α-淀粉酶酶濃度、液料比、制備時(shí)間、緩沖液pH值、制備溫度對(duì)膳食纖維質(zhì)量的影響，并采用正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶制備最佳工藝。通過(guò)本研究可以推動(dòng)酶法制備高質(zhì)量膳食纖維的深入研究，為商業(yè)化生產(chǎn)提供更好的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

檸檬皮渣：四川安岳檸檬加工廠。

1.1.2 試劑

木瓜蛋白酶（800 U/mg）、α-淀粉酶（40 U/mg）：食品級(jí)，上海金穗生物科技有限公司；95%乙醇、檸檬酸、檸檬酸三鈉、丙酮：分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：上海興創(chuàng)科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；TD5-I離心機(jī)：四川署科儀器有限公司；SHB-B95循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海洪都電子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料處理

檸檬皮渣初步篩選，去除雜物和變質(zhì)皮渣，放入皮重2倍～3倍的水中，加熱煮沸5 min～10 min，水浸泡洗滌至無(wú)色，50℃干燥，粉碎過(guò)60目備用。

1.2.2 復(fù)合酶制備膳食纖維

稱(chēng)取5.0 g預(yù)處理后的檸檬粉，加入一定量的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液，一定量的木瓜蛋白酶以及α-淀粉酶，在一定的溫度下攪拌一定時(shí)間，加熱至95℃，滅酶5 min。制備條件：料液比為1∶10（g/mL）～1 ∶30（g/mL）；木瓜蛋白酶用量為 0.2 mg/g～1.8 mg/g；α-淀粉酶用量為 1.0 mg/g ～5.0 mg/g；pH 3～7；時(shí)間10 min～120 min；溫度 35℃～75℃。

1.2.3 制備可溶性膳食纖維

過(guò)濾：將滅酶后的樣品離心分離，熱水洗滌一次，合并上清液。醇析：上清液減壓濃縮至二分之一，用3倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇醇析，靜置15 min。

提純：抽濾后，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇、體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇各洗滌2次，50℃干燥。

1.2.4 制備不溶性膳食纖維

煮沸：過(guò)濾后所得濾渣中加入100 mL去離子水，加熱至沸騰并持續(xù)1 min～5 min。

過(guò)濾：趁熱抽濾并用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇及丙酮各洗滌2次，50℃干燥。

1.2.5 制備總膳食纖維

醇析：滅酶后的樣品減壓濃縮至二分之一，冷卻至20℃。用3倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇醇析，靜置30 min。

提純：抽濾后，分別用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇、體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇、丙酮洗滌2次，50℃干燥。

1.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇pH值、制備溫度、制備時(shí)間、木瓜蛋白酶用量、α-淀粉酶用量5個(gè)試驗(yàn)因素為研究對(duì)象選用L16（45）進(jìn)行正交試驗(yàn)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in orthogonal design

1.4 膳食纖維的分析

1.4.1 樣品膳食纖維含量的測(cè)定

采用GB 5009.88-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中膳食纖維的測(cè)定》測(cè)定膳食纖維含量[20]。

1.4.2 殘?jiān)谢曳值臏y(cè)定

依照GB 5009.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》直接灰分法進(jìn)行。

1.4.3 殘?jiān)械鞍踪|(zhì)的測(cè)定

依照GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》凱氏定氮法進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Origin 2018軟件制圖，用正交設(shè)計(jì)助手II專(zhuān)業(yè)版V3.1分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 木瓜蛋白酶的影響

控制 α-淀粉酶 2 mg/g，料液比 1∶20（g/mL），制備緩沖液pH值為6，制備溫度為45℃，制備時(shí)間30 min，木瓜蛋白酶酶量對(duì)膳食纖維得率的影響如圖1所示。

圖1 木瓜蛋白酶濃度對(duì)膳食纖維得率的影響Fig.1 Effect of papain concentration on the extracting rate of dietary fiber

由圖1可知，當(dāng)酶量為0.2 mg/g～0.8 mg/g時(shí)，可溶性膳食纖維得率隨酶量的增加而持續(xù)增加，但繼續(xù)增加時(shí)，可溶性膳食纖維得率則趨于穩(wěn)定，而不溶性膳食纖維得率則持續(xù)降低。這是因?yàn)樵诿噶繛?.2 mg/g～0.8 mg/g時(shí)，可以酶解的不溶性膳食纖維未反應(yīng)完全，而酶量大于0.8 mg/g后酶解不溶性膳食纖維的反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，部分可溶性膳食纖維酶解為溶于乙醇的小分子[21-22]，原料酶解反應(yīng)趨于平衡，可溶性膳食纖維得率不再增加但不溶性膳食纖維仍在減少。所以0.8 mg/g（640 U/g）左右為較佳酶濃度。

2.1.2 α-淀粉酶的影響

α-淀粉酶酶濃度對(duì)膳食纖維得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 α-淀粉酶酶濃度對(duì)膳食纖維得率的影響Fig.2 Effect of α-amylase concentration on the extracting rate of dietary fiber

由圖2知，α-淀粉酶用量在1 mg/g～3 mg/g時(shí)可溶性膳食纖維的得率增長(zhǎng)少，整體表現(xiàn)為先增加后減少。在α-淀粉酶酶量較少時(shí)主要由木瓜蛋白酶與原料作用反應(yīng)，而α-淀粉酶酶反應(yīng)較少，而后升高是因含量增加，再降低是因?yàn)檫^(guò)多α-淀粉酶會(huì)附著在細(xì)胞壁上影響木瓜蛋白酶的反應(yīng)，使可溶性膳食纖維得率降低。不溶性膳食纖維則表現(xiàn)為持續(xù)降低后增加，降低原因來(lái)自可溶性膳食纖維的減少和淀粉的減少，升高則是因原料中有未反應(yīng)完全的不溶性膳食纖維導(dǎo)致的，可確定α-淀粉酶在3.0 mg/g～4.0 mg/g（120 U/g～160 U/g）之間最為合適。

2.1.3 緩沖液pH值的影響

緩沖液pH值對(duì)膳食纖維得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 緩沖液pH值對(duì)膳食纖維得率的影響Fig.3 Effect of pH on the extracting rate of dietary fiber

由圖3可知，溶液pH值在低于4之前，幾乎無(wú)可溶性膳食纖維產(chǎn)出，表明兩種酶在pH＜4時(shí)活性均很低。pH值從4.0到6.0可看出，可溶性膳食纖維得率迅速增加，這是因?yàn)殡SpH值增加酶的活性迅速增加；在6.0至7.0之間，得率則開(kāi)始降低，因此，可確定雙酶在pH值為6時(shí)共同作用最佳。

2.1.4 料液比的影響

料液比對(duì)膳食纖維得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)膳食纖維得率的影響Fig.4 Effect of ratio of raw material to liquid on the extracting rate of dietary fiber

料液比的影響如圖4所示，當(dāng)其比例大于1∶20（g/mL）時(shí)，SDF得率隨料液比的減小而增加。這是因?yàn)樵谌芤狠^少時(shí)，酶在檸檬皮細(xì)胞內(nèi)無(wú)充分?jǐn)U散的空間，使其未能反應(yīng)完全，隨溶液的增加反應(yīng)越加充分，因此得率增加，當(dāng)料液比小于1∶30（g/mL）后，SDF得率有所下降[23]。其原因是酶用量一定，當(dāng)溶液過(guò)多時(shí)，而酶解時(shí)間較短，酶液來(lái)不及擴(kuò)散，部分IDF未能被酶反應(yīng)，IDF收率略有增加，TDF基本穩(wěn)定。因此，可確定料液比 1∶20（g/mL）為最佳比例。

2.1.5 制備溫度的影響

制備溫度對(duì)膳食纖維得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 制備溫度對(duì)膳食纖維得率的影響Fig.5 Effect of modification temperature on the extracting rate of dietary fiber

由圖5可知，SDF在45℃～65℃之間得率較高，而低于45℃或者高于65℃時(shí)得率均較低，主要原因是木瓜蛋白酶及α-淀粉酶在45℃～65℃之間時(shí)活性較高[24-25]，溫度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)導(dǎo)致酶的活性下降，從而導(dǎo)致得率下降，因此，制備溫度可選擇在45℃至65℃之間。

2.1.6 制備時(shí)間的影響

制備時(shí)間對(duì)膳食纖維得率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 制備時(shí)間對(duì)膳食纖維得率的影響Fig.6 Effect of modification time on the extracting rate of dietary fiber

由圖6可知，隨著時(shí)間的增加，SDF得率持續(xù)增加并趨于穩(wěn)定，IDF得率則表現(xiàn)為持續(xù)降低并趨于穩(wěn)定。由圖6可以看出，反應(yīng)時(shí)間在20 min即可分解大部分檸檬粉，50 min即能完全反應(yīng)。因此，本法制備DF時(shí)間若時(shí)間大于50 min將無(wú)實(shí)際意義。綜合時(shí)間及得率考慮，可定30 min為最佳提取時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiments

因IDF得率受SDF得率的影響，因此，正交試驗(yàn)以SDF得率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。極差分析可知，在復(fù)合酶提取膳食纖維中，5個(gè)單因素對(duì)提取檸檬中SDF得率影響的主次關(guān)系依次為pH值＞溫度＞木瓜蛋白酶用量＞制備時(shí)間＞α-淀粉酶用量，制備時(shí)間和α-淀粉酶用量影響小。SDF得率的最佳組合為：A3B4C4D3E4，綜合能耗、酶成本等各因素并結(jié)合對(duì)制備效果的影響程度分析可確定最佳條件為：A3B4C2D3E1即pH 6.0，制備溫度60℃，制備時(shí)間30 min，木瓜蛋白酶用量0.8 mg/g（640 U/g），α-淀粉酶用量 2.4 mg/g（96 U/g），料液比1 ∶20（g/mL）。

按上述確定的最佳工藝條件做3次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果為SDF得率為（28.2±0.6）%，高于試驗(yàn)中的所有組合，IDF 得率為（42.2±1.2）%，SDF/TDF=（39.8±1.6）%，超過(guò) 30%[9-10]。

2.3 原料及產(chǎn)品成分分析

取預(yù)處理后的檸檬粉、最佳工藝提取的SDF與IDF各稱(chēng)取3份，按食品中膳食纖維測(cè)定的國(guó)標(biāo)法（GB 5009.88-2014）中酶-重量法進(jìn)行含量分析[15]，原料及產(chǎn)品成分分析見(jiàn)表3。

表3 原料及產(chǎn)品成分分析Table 3 Materials and products composition analysis

試驗(yàn)結(jié)果如表3，檸檬皮中TDF、IDF、SDF平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66.2%、45.0%、21.2%；最佳工藝提取的產(chǎn)品中，TDF粗品成分平均值分別為73.0%、43.2%、28.9%；IDF及SDF粗品各自的純度為74.0%、72.4%。酶法制備的膳食纖維SDF的含量增加超過(guò)20%，說(shuō)明酶法制備提高了SDF含量，降低IDF含量。所得的DF產(chǎn)品純度達(dá)到了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中純度的要求。并且，膳食纖維得率較高，說(shuō)明酶解反應(yīng)較為完全，復(fù)合酶制備膳食纖維優(yōu)勢(shì)明顯。

3 結(jié)論

本文研究利用木瓜蛋白酶及α-淀粉酶雙酶改性制備檸檬膳食纖維。通過(guò)正交試驗(yàn)得出復(fù)合酶制備檸檬膳食纖維的最佳工藝：木瓜蛋白酶和α-淀粉酶按質(zhì)量比1∶3混合作為復(fù)合酶，復(fù)合酶用量3.2 mg/g，pH 6.0，制備溫度60℃，制備時(shí)間 30 min，料液比 1∶20（g/mL）。試驗(yàn)原料為加工副產(chǎn)物，不僅充分利用了資源，而且還減少了污染。用復(fù)合酶法制備膳食纖維，不僅能縮短反應(yīng)所需時(shí)間，提高效率，而且還能除去蛋白質(zhì)、淀粉等物質(zhì)，提高其純度。因此，復(fù)合酶法水解、制備檸檬皮膳食纖維既可為檸檬皮渣新增盈利渠道，提高其附加值，又可以推動(dòng)酶法制備膳食纖維的發(fā)展。