微生物法測(cè)定腐乳中維生素B12含量的研究

（浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院鑒湖學(xué)院，浙江紹興312000）

維生素 B12（vitamin B12，VB12）也稱為鈷胺素（cobalamin），是唯一一種含有金屬元素的B族維生素。維生素B12能夠通過(guò)作為輔酶來(lái)參與蛋白質(zhì)與核酸的合成，在人體的代謝過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[1]。維生素B12是在維持大腦正常功能中起關(guān)鍵作用的必需營(yíng)養(yǎng)素，主要用于生成神經(jīng)脂蛋白并維持神經(jīng)髓鞘的生理功能，能夠提高葉酸的利用率，預(yù)防抑郁癥、老年癡呆及貧血等[2]。人體缺少維生素B12會(huì)造成脊髓變形、精神抑郁、消化道黏膜發(fā)炎，增加患心臟病的機(jī)率，是一種人體必不可少的水溶性維生素。但是，這種維生素人體不能自主合成，并且植物性食物中VB12的含量極少，人體只能通過(guò)動(dòng)物性食品或藥品進(jìn)行補(bǔ)給[3]。食品中的維生素B12通常是通過(guò)微生物代謝的方式進(jìn)行合成，因此發(fā)酵食品中的維生素B12的含量較高，如泡菜、腐乳、醬油、納豆等。其中，腐乳是典型的大豆發(fā)酵制品，含有多種必需氨基酸、有機(jī)酸。通過(guò)微生物發(fā)酵，腐乳會(huì)代謝產(chǎn)生一些益生物質(zhì)，其中維生素B12是一種重要的益生成分[4]，但其在腐乳中的含量研究較少。

目前，測(cè)定維生素B12的方法主要有分光光度法、原子吸收法[5]、微生物法及高效液相色譜法[6-7]等。但是發(fā)酵食品的基質(zhì)較為復(fù)雜，利用儀器測(cè)定維生素B12的含量干擾性較大、準(zhǔn)確性較低。而微生物法是國(guó)際上測(cè)定維生素B12含量公認(rèn)的方法，主要原理是菌種在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)維生素具有特異性需求，通過(guò)選取特定菌種對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，并根據(jù)繁殖程度進(jìn)行判斷。再通過(guò)維生素B12的含量與吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出維生素B12的含量[8]。沈泓等[9]采用微生物法檢測(cè)食品中維生素B12的含量，結(jié)果表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。此種方法能夠準(zhǔn)確、靈敏的測(cè)定維生素B12含量較低、基質(zhì)較復(fù)雜的樣品。因此，本試驗(yàn)采用微生物法，通過(guò)萊士曼氏乳酸桿菌測(cè)定不同種類的腐乳（白腐乳、紅腐乳、青腐乳、玫瑰腐乳）中維生素B12的含量，為腐乳制品中維生素B12的含量提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白腐乳、紅腐乳、青腐乳、玫瑰腐乳：市售；萊士曼氏乳酸桿菌（LactobacillusleichmanniiATCC7830）：上海北諾生物科技有限公司；維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：美國(guó)Sigma公司；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：江蘇酶聯(lián)生物科技有限公司；維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基：美國(guó)BD公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JD500-2電子天平：沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司；PHS-25型pH計(jì)：上海精科雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將萊士曼氏乳酸桿菌活化后轉(zhuǎn)種3代，離心棄去上清液，加入10 mL 9%生理鹽水，混勻，重復(fù)操作3次。在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)試菌液60%～80%的透光率，立即取1 mL測(cè)試菌液并稀釋10倍（靜置時(shí)間為0 h），在550 nm處測(cè)試菌懸液的吸光度，使其透光率在60%～80%之間。

按上述操作，測(cè)試菌懸液靜置1、2、3 h后，各吸取1 mL測(cè)試菌液并稀釋10倍后進(jìn)行培養(yǎng)，并將9%生理鹽水分別換成無(wú)菌水、磷酸鹽緩沖液、維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)。

1.3.2 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取1 mg VB12標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋至含VB12質(zhì)量濃度分別為 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 ng/mL，在使用前120℃滅菌5 min后迅速冷卻。取1.0 mL上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液于5 mL培養(yǎng)基，再使用滅菌水定容至10 mL，平行3份，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品處理

采用100 mL蒸餾水將1.3 g無(wú)水磷酸氫二鈉、1.0 g無(wú)水偏重亞硫酸鈉、1.2 g檸檬酸溶解，取10 mL加入一定量的腐乳樣品（白腐乳、紅腐乳、青腐乳、玫瑰腐乳），加入150 mL蒸餾水并超聲振蕩處理0.5 h，而后121℃水解10 min冷卻后調(diào)節(jié)pH值至4.5，蒸餾水定容至250 mL后過(guò)濾，取濾液5 mL，加入20 mL蒸餾水，調(diào)pH值至中性并定容至100 mL。

1.3.4 樣品待測(cè)液的制備及培養(yǎng)

取 1、2、3、4、5 mL 樣品溶液于 5 mL 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，再使用滅菌水定容至10 mL。接種菌懸液（靜置1 h，維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基）50 μL（對(duì)照組的樣品管除外）于上述培養(yǎng)管中并36℃進(jìn)行培養(yǎng)36 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)曲線

以維生素B12的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定的吸光度為縱坐標(biāo)繪制VB12標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of vitamin B12

由圖1可知，維生素B12質(zhì)量濃度為0.01 ng/mL～0.10 ng/mL時(shí)，回歸方程為y=4.162 6x+0.080 2，R2=0.994 4，線性關(guān)系良好，能夠用其計(jì)算VB12的含量。

2.2 菌懸液放置時(shí)間與培養(yǎng)菌液對(duì)菌落總數(shù)的影響

表1為在相同的試驗(yàn)步驟和數(shù)據(jù)參數(shù)下，菌懸液放置不同時(shí)間和不同種類的培養(yǎng)菌液對(duì)菌落總數(shù)的影響。

表1 菌懸液放置時(shí)間與培養(yǎng)菌液對(duì)菌落總數(shù)的影響Table 1 The effect of culture medium and time of bacterial suspension on the total number of colonies

菌懸液在放置0 h時(shí)，不同種類的培養(yǎng)菌液對(duì)菌落總數(shù)的影響并不顯著，菌落總數(shù)的范圍在3.1×106CFU～4.9×106CFU。菌懸液放置1 h后，9%生理鹽水的處理組菌落總數(shù)顯示出增加的趨勢(shì)，然而無(wú)菌水和磷酸鹽緩沖溶液的處理組菌落總數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。但是菌懸液在放置2 h后，9%生理鹽水、無(wú)菌水和磷酸鹽緩沖溶液菌落總數(shù)均呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)，分別降至3.4×106、0.03×106CFU 和 0.007 4×106CFU。在放置 3 h時(shí)菌落總數(shù)分別降低至 0.7×106、0.000 3×106CFU 和0.000 8×106CFU。這可能是9%生理鹽水、無(wú)菌水和磷酸鹽緩沖溶液因滲透壓的影響，并且缺少萊士曼氏乳酸桿菌所需的營(yíng)養(yǎng)成分的緣故。當(dāng)培養(yǎng)菌液為維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基時(shí)，菌懸液放置時(shí)間為1 h～3 h，菌落總數(shù)均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，達(dá)到8.2×106CFU～9.0×106CFU。可見(jiàn)4種稀釋液中只有維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基作為稀釋液時(shí)，菌落總數(shù)能夠處于增加并趨于穩(wěn)定。綜合考慮試驗(yàn)時(shí)間的優(yōu)化，采用菌懸液放置1 h并選用維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基作為稀釋液進(jìn)行菌種的培養(yǎng)。

2.3 不同廠家腐乳中維生素B12含量分析

本試驗(yàn)選取了4種不同種類的腐乳制品，其中包括紅腐乳、白腐乳、青腐乳、玫瑰腐乳，每種腐乳選取3個(gè)不同廠家的產(chǎn)品應(yīng)用微生物法測(cè)定維生素B12的含量。表2為不同廠家4種類型的腐乳中VB12的含量以及4種類型的腐乳維生素B12的平均含量。

表2 不同種類腐乳中維生素B12的含量Table 2 Vitamin B12content in different kinds of sufu

相關(guān)數(shù)據(jù)表明大豆中幾乎不含有維生素B12，但其經(jīng)過(guò)發(fā)酵后維生素B12的含量顯著增加。在本試驗(yàn)中，紅腐乳中維生素 B12的含量 0.54 μg/100 g～0.76 μg/100 g之間，白腐乳中維生素B12的含量0.41 μg/100 g～0.58 μg/100 g，而青腐乳（即臭腐乳）中維生素 B12的含量為 5.12 μg/100 g～7.01 μg/100 g 之間，玫瑰腐乳中維生素 B12的含量為 3.73 μg/100 g～4.08 μg/100 g 之間。可見(jiàn)，大豆經(jīng)過(guò)發(fā)酵后都能夠合成維生素B12。曲勤鳳等[10]研究了腐乳、韓國(guó)大醬、豆豉等發(fā)酵食品，結(jié)果表明腐乳中尤其是臭腐乳的維生素B12的含量遠(yuǎn)高于其他的發(fā)酵食品。同一類型的腐乳中維生素B12含量存在明顯的差異性，這可能是每個(gè)廠家的生產(chǎn)工藝和控制要求不同，此外在腐乳的發(fā)酵過(guò)程中選用的菌種對(duì)腐乳中維生素B12的含量也有一定的影響。萬(wàn)紅芳等[11]通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)霉菌、酵母、芽孢桿菌、乳酸菌等微生物影響著腐乳的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分。曹蕾蕾等[12]利用少孢根霉發(fā)酵腐乳，并在發(fā)酵前期使用乳酸優(yōu)化生長(zhǎng)環(huán)境，使得腐乳中的維生素B12含量的顯著增加。

2.4 不同種類腐乳中維生素B12平均含量分析

圖2為每種腐乳3個(gè)廠家VB12的平均含量。

圖2 不同種類腐乳中維生素B12的含量Fig.2 The content of vitamin B12in different kinds of sufu

在本試驗(yàn)中，紅腐乳中維生素B12的平均含量為0.63 μg/100 g，白腐乳中維生素 B12的平均含量 0.49 μg/100 g，而青腐乳（即臭腐乳）中維生素B12的平均含量為7.01 μg/100 g，玫瑰腐乳中維生素B12的平均含量為3.87 μg/100 g。4種腐乳中青腐乳的維生素B12的含量最高，可見(jiàn)青腐乳在發(fā)酵過(guò)程中除了分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸外，還合成了更多的維生素B12，其含量可達(dá)紅腐乳和白腐乳的10倍多（P＜0.05）。這可能因?yàn)榍喔橄鄬?duì)于其他類型的腐乳發(fā)酵的更為徹底，環(huán)境中能夠合成維生素B12的菌種更多，從而產(chǎn)生了更多的維生素B12。另外，玫瑰腐乳中維生素B12的含量為紅腐乳和白腐乳7倍多（P＜0.05），是因?yàn)槊倒甯橹忻倒宄煞纸?jīng)過(guò)發(fā)酵后也產(chǎn)生了較多的營(yíng)養(yǎng)成分，維生素B12的含量高于紅腐乳和白腐乳。同樣，余明遠(yuǎn)[13]通過(guò)對(duì)比玫瑰腐乳與普通腐乳中的營(yíng)養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)玫瑰腐乳中含有較高的維生素B12，紅腐乳、白腐乳中維生素B12的含量相對(duì)較少，人體內(nèi)缺乏維生素B12時(shí)很難通過(guò)食用紅腐乳、白腐乳進(jìn)行補(bǔ)充，且植物性食物中幾乎不含有維生素B12，素食主義者可以通過(guò)適當(dāng)?shù)氖秤们喔楹兔倒甯閬?lái)補(bǔ)充人體所需的維生素B12。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)表明將菌懸液放置1 h并選用維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基作為稀釋液利于菌種的培養(yǎng)，以紅腐乳、白腐乳、青腐乳和玫瑰腐乳這4種腐乳為研究對(duì)象，采用微生物法對(duì)其維生素B12的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，不同廠家生產(chǎn)的腐乳維生素B12含量存在顯著差異。4種腐乳中，紅腐乳和白腐乳中維生素B12的含量較低。青腐乳因比其他類型的腐乳發(fā)酵更為徹底而具有最高的維生素B12，是紅腐乳和白腐乳的10倍多。玫瑰腐乳中的玫瑰成分經(jīng)過(guò)發(fā)酵后會(huì)產(chǎn)生較多的營(yíng)養(yǎng)成分，維生素B12的含量也較高。本文旨在為腐乳等相關(guān)發(fā)酵食品中維生素B12的研究提供試驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)參考。