DACH1 在肝癌中的生物學作用及機制

陳曉星，翟 廣，戈佳云，魏 東，施智甜，郭志唐，王 滔，趙松凌，王連敏，王 琳

（昆明醫科大學第二附屬醫院肝膽外科，云南昆明 650101）

原發性肝癌（Primary carcinoma of the liver），簡稱肝癌，是原發于肝臟的上皮性惡性腫瘤，其中超過90%的肝癌為肝細胞癌，每年約有70 萬新患者被確診[1-2]。原發性肝癌目前是我國第4 位常見惡性腫瘤，肝細胞癌嚴重危害我國人民的身體健康，也給社會及人們帶來巨大的損失[3-4]。就目前，肝癌的治療主要包括根治性治療和姑息治療。根治性治療包括肝臟移植、手術切除和局部消融治療；姑息性治療如藥物治療、放療、化療等。但許多肝癌患者在發現時即為中晚期，能接受的治療方式十分有限[5-7]。因此，闡明肝癌的發病機制、尋找敏感和特異的肝癌早期分子診斷標志物，將有利于肝癌的早期診斷和及時治療，對提高患者治愈率和生存率具有重要意義。

人類Dachshund1（DACH1）基因是果蠅Dac基因的同源基因，位于染色體13q22，其編碼的蛋白質主要分布于細胞核內。可以通過與c-Jun、Smads、Six 和ER 等轉錄因子相互作用，在基因轉錄調控方面發揮重要功能[8-9]。DACH1 作為正常生理過程中血管重塑及上皮細胞遷移等作用的重要調控因子[10]，在乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌、等多種腫瘤中作為腫瘤抑制因子，且有許多證據顯示其可作為多種腫瘤預后的標志物[11-12]。本研究進一步探討DACH1 在肝癌中的生物學作用及其作用機制，以期為肝癌的早期診斷、治療和預后評估提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

正常肝細胞株LO2；以及三株肝癌細胞系（HepG2、Hep3B、Huh7）由中國科學院昆明動物研究所提供。

成年雄性BALB/C-nu/nu 小鼠，體重（18±2）g，由昆明醫科大學實驗動物學部提供。

1.2 臨床樣本采集

樣本來源于2019 年5 月至2020 年2 月昆明醫科大學第二附屬醫院肝膽外科行根治性肝癌切除術的HCC 患者30 例，納入標準：臨床資料完整；術前均無其他治療，如TACE、免疫治療等，患者已簽訂知情同意書，并且該實驗臨床樣本通過了昆明醫科大學第二附屬醫院倫理學審查。

1.3 藥品及試劑

碧云天生物技術有限公司的檢測蛋白濃度BCA 試劑盒（上海）；索萊寶科技有限公司的HE（蘇木素-伊紅）試劑染色盒（北京）；DACH1 抗體、CyclinD1 抗體、CDK4 抗體、CyclinE1 抗體、CDK2 抗體購自Abcam 公司；SP 免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋科技公司）；DMEM 培養基、胎牛血清和Lipofectamine2000TM購自Thermo Fisher Scientific 公司；CCK8 試劑盒購自日本同仁公司，PI 染色試劑盒購自BD 公司，DACH1 慢病毒表達載體購自復能公司。

1.4 免疫組織化學染色

石蠟切片由4 ℃取出復溫2 h，再烤片60℃1 h。二甲苯中脫蠟，依次放入100%、95%、85%、75%乙醇和ddH2O 中水化。然后，放入3%的甲醇過氧化氫液中，室溫靜置20 min。高壓修復，冷卻至室溫。覆蓋50 μL 封閉液（1%BSA），37 ℃封閉30 min 后，去除封閉液，覆蓋DACH1 一抗（1:200）4℃過夜。第2 天取出后，室溫復溫15 min，加SP 免疫組化試劑盒中二抗，37℃孵箱孵育30 min，滴加現配的DAB 顯色液，蘇木素染液復染梯度酒精脫水、二甲苯（15 min），取出切片晾干后，用中性樹脂封片，免疫組化每張切片選取中心和4個周邊共計5 個高倍視野觀察，用Image-pro Plus 6.0 軟件計算陽性比率。

1.5 細胞培養

所有的肝癌細胞系和用于包裝的293T 細胞都是來自中國科學院昆明動物研究所。所有細胞在DMEM 培養基中補充10%的胎牛血清中，細胞在37℃5% CO2培養箱中培養。細胞轉染使用Lipofectamine2000TM。

1.6 慢病毒包裝和感染

使用的DACH1 慢病毒表達載體采用復能公司病毒包裝系統通過293T 細胞包裝DACH1 過表達和對照慢病毒。采用慢病毒液和培養基1:1 比例感染肝癌細胞，在感染72 h 后收集細胞并進行Western blotting 以評估DACH1 蛋白的表達。

1.7 Western blotting 分析

通過Western blotting 檢測肝癌細胞系：LO2、HepG2、Hep3B、Huh7。簡要地說，使用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，然后，蛋白質用BCA 蛋白測定試劑盒定量。然后，樣本通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜。β-肌動蛋白為內參對照，用5%的無脂牛奶封閉，一抗體分別孵育：小鼠抗DACH1 抗體（1:1000），小鼠抗β-Actin 抗體（1:5 000）。然后將膜與二抗一起孵育（山羊抗小鼠IgG）。后進行顯影，曝光。蛋白條帶使用Image J 軟件進行灰度分析并計算相對蛋白表達。

1.8 細胞增殖測定

使用CCK8 估算存活細胞的數量。感染后24 h，HepG2 細胞接種在96 孔板中。含有10%FBS的培養基，密度為2 000 個細胞/孔。為了定量細胞活力，將培養物染色在24、48、72、96 h 后每孔添加10 μL CCK8 溶液在37℃下孵育2 h，之后吸光度是在450 nm 下使用酶標儀檢測OD 值。

1.9 細胞周期分析

感染48 h 后，兩者胰蛋白酶消化后收集漂浮細胞和貼壁細胞用冰冷的PBS 洗滌；然后在-20℃使用70%的PBS 乙醇將細胞固定過夜。固定細胞然后用20 μg/mL RNaseA 和50 μg/mL 處理碘化丙錠在室溫下放置30 min；然后將染色的細胞立即染色使用Accuri C6 流式細胞儀。使用隨附的軟件分析數據，以及平均值和標準偏差-進行計算。每個樣本1 0000個細胞，并將實驗重復三遍。

1.10 細胞周期相關蛋白質通過Western blotting分析檢測（方法同2.3 部分）

感染48 h 后進行周期相關蛋白檢測，一抗體分別孵育：小鼠抗CyclinD1 抗體（1:2 000）；小鼠抗CDK4 抗體（1:1 000）；小鼠抗CyclinE1 抗體（1:1 000）；小鼠抗CDK2 抗體（1:500）。

1.11 裸鼠成瘤實驗

BALB/C-nu/nu 小鼠8 只裸鼠隨機分為兩組：a慢病毒對照HepG2 細胞組；b 表達DACH1 慢病毒HepG2 細胞組。將感染的HepG2 細胞（2×106）重懸100 μL 的無血清DMEM 中，相同體積的基質膠混合后皮下注射接種到BALB/ C 裸鼠一個點。接種第10 天腫瘤形成按照第0 天開始測量腫瘤大小，按照第3、6、9 天測量腫瘤大小，腫瘤的長徑（a）和短徑（b）進行測量，然后使用公式V=1/2a×b2。第9 天對動物實施安樂死，并取出腫瘤，稱重并進行免疫組織化學觀察DACH1 表達情況。

1.12 統計學處理

2 結果

2.1 DACH1 在肝癌組織中的表達水平

免疫組化染色后，DACH1 陽性呈棕黃色，且定位于細胞核，HCC 癌組織中DACH1 的表達低于癌旁組織（圖1）。Normal 組與術HCC 癌組織相比有統計學差異（61.87 ± 1.771）vs （28.79 ±2.079），P<0.05。

圖1 HCC 患者癌組織和正常組織中DACH1 的表達（×200）Fig.1 Expressions of DACH1 in cancer and normal tissues of HCC patients （×200）

2.2 DACH1 在肝癌細胞中的表達水平

研究DACH1 在肝癌細胞中的表達水平，正常肝細胞株LO2；以及三株肝癌細胞系（HepG2、Hep3B、Huh7）分析。結果顯示所有細胞系均表達DACH1，正常細胞水平高于肝癌細胞水平。另外，我們的結果表明在HepG2 細胞系中DACH1 的表達明顯低于其他細胞系，見圖2。

圖2 通過蛋白質印跡檢測DACH1 蛋白水平Fig.2 DACH1 protein levels detected by Western blotting

2.3 DACH1 蛋白表達抑制HepG2 細胞增殖

蛋白質印跡分析檢測表達DACH1 慢病毒感染和對照病毒感染的HepG2 細胞中DACH1 蛋白表達情況，根據結果，DACH1 顯著在DACH1 慢病毒感染中過表達（圖3A）。

使用CCK8 法測定DACH1 慢病毒感染和對照病毒感染的HepG2 細胞的增殖。分別在24、48、48，96 h 測定OD 值，結果顯示DACH1 慢病毒感染細胞增殖明顯低于對照病毒感染細胞，表明高表達DACH1 的細胞生長是明顯被抑制（圖3B）。

2.4 DACH1 上調影響HepG2 細胞周期分布

慢病毒感染后48 h 后通過流式細胞術檢測HepG2 細胞周期分布。結果顯示被DACH1 上調細胞表現出G0/G1 期細胞較多，而S 期細胞較少與對照感染的細胞相比（52.80±3.18）vs（67.82±2.41），P< 0.01；（32.77±1.94）vs（22.91±1.90），P< 0.01。G2/M 期兩者之間沒有明顯區別（圖4）。

2.5 DACH1 上調影響HepG2 細胞周期相關蛋白表達情況

慢病毒感染后48 h 后通過蛋白質印跡分析檢測HepG2 細胞周期相關蛋白CyclinD1、CDK4、CyclinE1、CDK2。結果顯示被DACH1 上調細胞表現出周期相關蛋白CyclinD1、CDK4、CyclinE1、CDK2 表達都下調，與對照慢病毒感染的細胞比較[（0.78±0.04）vs （0.42±0.06），P< 0.01]；[（0.56±0.03）vs （0.36±0.05），P< 0.05]；[（0.64 ±0.03）vs（0.27 ±0.02），P< 0.01]；[（0.71±0.07）vs（0.47±0.06），P<0.05]，見圖5。

2.6 DACH1 上調有助于抑制腫瘤生長

檢測DACH1 在腫瘤生長作用，用表達DACH1，對照的慢病毒，并接種到BALB/C 裸鼠的皮下。由DACH1 感染的細胞導致的腫瘤重量大約減輕了三倍與對照感染細胞比。通過腫瘤形成后0、3、6、9 d 測量腫瘤體積可見DACH1 感染的細胞腫瘤生長速度明顯減慢（圖6A）。免疫組化染色后，DACH1 陽性呈棕黃色，且定位于細胞核（圖6B），DACH1 感染的細胞接種的腫瘤中DACH1 的表達高于對照感染細胞接種的腫瘤有統計學差異[（5.89±0.23）vs（16.77±0.79），P<0.01]。

圖3 DACH1 過表達時細胞增殖情況Fig.3 Cell proliferation during overexpression of DACH1

圖4 流式細胞術檢測HepG2 細胞周期

圖5 DACH1 過表達時周期相關蛋白的變化情況Fig.5 Changes of periodic related proteins during overexpression of DACH1

圖6 DACH1 調節肝癌的發生（×200）Fig.6 DACH1 regulated the tumorigenesis of HCC cancer （×200）

3 討論

近年來多項研究表明DACH1 基因在多種癌細胞中呈現低表達，在多種腫瘤中發揮了抑癌基因的作用，DACH1 基因抑制細胞增殖和遷移在乳腺癌細胞中得到證實[13-15]，在肺腺癌中，DACH1 可以抑制非小細胞肺癌的克隆形成和細胞增殖[16]，在前列腺癌中，DACH1 可以抑制前列腺癌細胞的DNA合成、增殖、克隆形成[15]。在肝癌中，本研究進一步證實DACH1 可能具有抑癌作用。筆者對DACH1 在肝癌中的生物學功能進行了研究，筆者發現DACH1 可以抑制肝癌細胞系HepG2 的增殖和裸鼠體內成瘤，表明DACH1 在體外和體內都可以抑制肝癌的生長。為了進一步探索DACH1 抑制肝癌細胞增殖的原因，筆者檢測了DACH1 對HepG2細胞周期的影響。結果表明，DACH1 可以使肝癌細胞系HepG2 的G0/G1 期細胞增多、S 期細胞減少。可見，DACH1 抑制肝癌細胞增殖主要是通過調控細胞周期來實現的。

細胞周期是一個非常復雜的過程，涉及到大量調節蛋白，細胞周期依賴性蛋白激酶（CDK2 和CDK4）和細胞周期蛋白（cyclinD1 和cyclinE1）是調控細胞周期的兩大家族，CDK4 和cyclin D1 在G0/G1 期表達升高，促進細胞從G0/G1 期向S 期轉變[16-19]，在這些蛋白的作用下，細胞按順序經過DNA 合成前期（G1）、DNA 合成期（S）、有絲分裂前期（G2）和有絲分裂期（M）。為了進一步證實DACH1 肝癌細胞增殖主要是通過調控細胞周期來實現，研究中對依賴性蛋白激酶（CDK2 和CDK4）和細胞周期蛋白（CyclinD1 和CyclinE1）的表達水平進行了檢測。結果顯示，DACH1 可以降低這些依賴性蛋白激酶和細胞周期蛋白的表達水平。從而證實，DACH1 可以誘導肝癌細胞系HepG2 細胞周期G1/S 阻滯。

綜合以上研究結果，DACH1 可以抑制肝癌細胞系HepG2 細胞增殖和裸鼠體內成瘤，在肝癌中發揮了抑癌基因的作用。DACH1 主要是通過誘導細胞周期G1/S 阻滯，使G1 期細胞增多、S 期細胞減少，從而抑制肝癌細胞的增殖。