PKG 信號通路在ACS 患者PCI 術(shù)后血管內(nèi)皮損傷中作用

董丹紅，龐璽倬，李 琳

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，云南昆明 650032）

心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion，IR）導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常、心肌壞死面積擴大、心臟破裂甚至死亡[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是IR 損傷中重要的靶細(xì)胞，是IR 損傷的始發(fā)及重要影響因素[2]。血管內(nèi)皮通過其屏障和分泌功能，成為影響心血管疾病發(fā)生、發(fā)展以及再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。

缺血后血管內(nèi)皮損傷以血管內(nèi)皮依賴性舒張損傷為典型特征，尤以一氧化氮（nitric oxide，NO）介導(dǎo)的血管內(nèi)皮舒張為代表。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活化左-精氨酸后產(chǎn)生NO，激活鳥苷酸（GC），產(chǎn)生cGMP，引起cGMP 依賴的蛋白激酶（protein kinase G，PKG）介導(dǎo)的血管舒張 。eNOS/cGMP/PKG 對內(nèi)皮依賴的舒張有重要作用。cGMP/PKG 信號通路調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的運動、遷移和增殖，對血管新生和血管的通透性及其重要。內(nèi)皮依賴的血管舒張主要是由eNOS/NO/GC/cGMP/PKG 信號通路介導(dǎo)的，NO/cGMP/PKG 通路在IR 損傷時具有心臟保護作用[4]。課題組研究發(fā)現(xiàn)，PKG 通路與IR 致血管內(nèi)皮損傷保護作用有關(guān)[5]。

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）是急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）患者的重要治療手段，PCI 術(shù)后可導(dǎo)致心肌IR 損傷，但是否會導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能損傷及PKG 信號通路在其中的作用，目前尚未見報道。本研究旨在探討ACS 患者PCI 治療與血管內(nèi)皮功能損傷的關(guān)系，以及eNOS/NO/PKG 信號通路的相關(guān)因子在其中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究納入2015 年6 月至2016 年1 月收住昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科確診為ACS 的患者52 例，均接受冠脈造影術(shù)，必要時行PCI 術(shù)，住院期間均接受冠心病藥物治療。所有患者按照是否接受PCI 治療分為PCI 組（n=33）和非PCI組（n=19）。入選標(biāo)準(zhǔn)：確診ACS 并行冠脈造影術(shù)的患者，ACS 診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中國相關(guān)指南[6-7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往發(fā)生過ACS，且在3 個月內(nèi)接受過PCI 治療；3 個月內(nèi)發(fā)生過腦梗死、肺栓塞及嚴(yán)重阻塞性肺疾病；血流動力學(xué)不穩(wěn)定；嚴(yán)重的心律失常；有嚴(yán)重肝、腎、肺功能損害；嚴(yán)重感染；妊娠；依從性差的患者。所有入試者均簽署知情同意書。

1.2 血流介導(dǎo)的血管舒張（flow mediate dilation，F(xiàn)MD）測定

所有患者入院后6 h 及術(shù)后24 h（PCI 組為PCI 術(shù)后，非PCI 組為冠脈造影術(shù)后）采用血管內(nèi)皮功能檢測儀（上海曙誠醫(yī)療科技發(fā)展有限公司，UNEX EF）測定FMD。患者在安靜狀態(tài)下，取仰臥位，連接心電、血壓監(jiān)測，右上肢外展15°，用機載超聲探頭置于肘上2～5 cm 處尋找并鎖定靶血管（即右上臂肱動脈），取肱動脈縱切面進行掃描，用二維超聲尋找并測量右上肢肱動脈內(nèi)徑，測值取三個心動周期的平均值。首先測量舒張末期血管內(nèi)徑（D0），獲得基礎(chǔ)值后，測量患者血壓，并根據(jù)測量的血壓值設(shè)定袖帶壓力。阻斷血流過程，袖帶將阻斷肱動脈血流5 min，之后釋放袖帶氣體而引起動脈內(nèi)反應(yīng)性充血，在放氣后的60～90 s 內(nèi)進行掃描，測量肱動脈內(nèi)徑（D1）。最后根據(jù)公式[（反應(yīng)后管腔內(nèi)徑-管腔基礎(chǔ)內(nèi)徑）/管腔基礎(chǔ)內(nèi)徑]得出FMD 的值。

1.3 外周血eNOS、NO、PKG 濃度檢測

入院后3 h 及術(shù)后6 h 分別抽靜脈血，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，4℃放置30min 后，1 000 r/min，離心15 min，收集血清凍存于-80℃低溫冰箱。采用ELISA 法，分別使用Human eNOS ELISA（NEOBIOLAB，HN0031）、Total Nitric Oxide and Nitrate Nitrite Parameter Assay（R&D，KGE001）和Human PKG ELISA Kit（LSBio，LS-F21271）試劑盒檢測eNOS、亞硝酸鹽和PKG 濃度，按試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例（%）表示，正態(tài)分布的計量資料用（）表示。計數(shù)資料采用χ2檢驗，四格表有理論頻數(shù)小于1 時，采用四格表確切概率法；PCI 術(shù)前、術(shù)后自身對照采用配對t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 ACS 患者PCI 組及非PCI 組基線信息比較（）Tab.1 Comparisons of baseline information between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

表1 ACS 患者PCI 組及非PCI 組基線信息比較（）Tab.1 Comparisons of baseline information between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

注：LVEF 為左室射血分?jǐn)?shù)，LVEDD 左心室舒張末期內(nèi)徑，ACS 為急性冠脈綜合征，ACEI 為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，ARB 為血管緊張素受體拮抗劑。

2 結(jié)果

2.1 基線資料比較

PCI 組和非PCI 組患者基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 FMD 比較

PCI 組FMD 值術(shù)后較術(shù)前降低（P＜0.05），PCI 組較非PCI 組術(shù)后FMD 值降低（P＜0.05），見表2。

2.3 eNOS 濃度比較

PCI 組和非PCI 組患者術(shù)后較術(shù)前eNOS 濃度均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而PCI 組術(shù)后較術(shù)前降低更明顯（P＜0.05），術(shù)后eNOS 濃度PCI 組較非PCI 組降低（P＜0.05），見表3。

2.4 亞硝酸鹽濃度（反映NO 含量）比較

PCI 組亞硝酸鹽濃度術(shù)后較術(shù)前降低（P＜0.01），術(shù)后亞硝酸鹽濃度PCI 組較非PCI 組降低（P＜0.01），見表4。

2.5 PKG 濃度比較及相關(guān)性分析

PCI 組PKG 濃度術(shù)后較術(shù)前顯著降低（P＜0.05），術(shù)后PKG 濃度PCI 組較非PCI 組降低（P＜0.05），見表5。PCI 組術(shù)前的PKG 濃度與術(shù)后FMD 值呈正相關(guān)（r=0.478，P=0.005），見圖1。

表2 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術(shù)前后FMD 比較（）Tab.2 A comparison of FMD before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients（）

表2 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術(shù)前后FMD 比較（）Tab.2 A comparison of FMD before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients（）

與PCI 組手術(shù)前比較，*P＜0.05；與非PCI 組手術(shù)后比較，△P＜0.05。

表3 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術(shù)前后eNOS 濃度比較（）Tab.3 A comparison of eNOS concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

表3 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術(shù)前后eNOS 濃度比較（）Tab.3 A comparison of eNOS concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

與PCI 組手術(shù)前比較，*P＜0.05；與非PCI 組手術(shù)后比較，△P＜0.05；與非PCI 組手術(shù)前比較，#P＜0.05。

表4 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術(shù)前后亞硝酸鹽濃度比較（）Tab.4 A comparison of nitrite concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

表4 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術(shù)前后亞硝酸鹽濃度比較（）Tab.4 A comparison of nitrite concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

與PCI 組手術(shù)前比較，*P＜0.05；與非PCI 組手術(shù)后比較，△P＜0.05。

表5 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術(shù)前后PKG 濃度比較（）Tab.5 A comparison of PKG concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

表5 ACS 患者PCI 組和非PCI 組手術(shù)前后PKG 濃度比較（）Tab.5 A comparison of PKG concentration before and after operation between PCI group and non-PCI group in ACS patients （）

與PCI 組手術(shù)前比較，*P＜0.05；與非PCI 組手術(shù)后比較，△P＜0.05。

圖1 PCI 組術(shù)前PKG 與術(shù)后FMD 的相關(guān)性Fig.1 Correlation between preoperative PKG and postoperative FMD in PCI group

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，ACS 患者冠狀動脈存在內(nèi)皮依賴性血管舒張功能異常，此功能異常同時累及周圍動脈，外周動脈和冠狀動脈血管反應(yīng)一致[8]，肱動脈的內(nèi)皮功能變化能間接反映冠狀動脈的內(nèi)皮功能情況。FMD 檢測是目前常用的無創(chuàng)內(nèi)皮功能檢測方法之一，其主要作用介質(zhì)是內(nèi)皮細(xì)胞衍生的NO，利用無創(chuàng)高分辨率超聲技術(shù)評估外周血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，可間接反映冠狀動脈內(nèi)皮功能。冠脈支架植入可造成急性冠脈內(nèi)皮損傷，有時可合并動脈夾層或血腫。正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過分泌前列環(huán)素和一氧化氮來防止血小板粘附、聚集和活化，并維持促凝（組織因子）、抗凝（肝素、蛋白C/S）和血栓溶解因子（組織纖溶酶原激活劑）之間的平衡。當(dāng)血管內(nèi)皮受損或功能失調(diào)時，其抗血小板功能減弱，促凝血活性增強；同時伴隨血管收縮，局部血流減少，這些因素可增加支架血栓形成的風(fēng)險[3]。本研究觀察到ACS 患者中，PCI 組術(shù)后FMD 值較術(shù)前顯著降低，而非PCI 組無明顯變化；術(shù)后FMD 值PCI 組較非PCI 組顯著降低，提示PCI 術(shù)后血管內(nèi)皮功能受損。PCI 組術(shù)后血管內(nèi)皮舒張功能受損，可能與以下因素有關(guān)：（1）PCI 術(shù)后引起的IR 可直接導(dǎo)致冠狀動脈血管內(nèi)皮損傷：正常狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞通過合成和釋放多種生物活性物質(zhì)維持血管功能完整性，但在IR 誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮損傷嚴(yán)重，導(dǎo)致冠狀動脈血管張力調(diào)節(jié)機能受損，加速冠狀動脈血管壁重塑、促進血小板活化和聚集等，加重心肌IR 損傷[9-10]；（2）手術(shù)過程中的機械損傷：PCI行支架植入術(shù)前先進行經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)，球囊對狹窄/閉塞的冠狀動脈進行機械性擴張及其引起的短暫性缺血，導(dǎo)致冠狀動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷；（3）損傷后再生的內(nèi)皮細(xì)胞存在功能異常：手術(shù)機械操作造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷或剝脫后，鄰近細(xì)胞可出現(xiàn)內(nèi)皮再生，但損傷后再生的內(nèi)皮細(xì)胞存在內(nèi)皮依賴性血管舒張能力的降低[3，11]。

研究表明，在血管內(nèi)皮和心肌中表達的eNOS能夠維持心臟和血管的正常生理功能，通過eNOS產(chǎn)生的NO 對缺血心肌具有保護作用[12-13]。eNOS/NO/GC/cGMP/PKG 信號通路介導(dǎo)內(nèi)皮依賴的血管舒張，PKG 被認(rèn)為是最重要的下游靶點[14]。PKG 在多種生理過程中發(fā)揮著核心作用，如調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的收縮和舒張、抗高血壓、抗心肌肥大、抗動脈粥樣硬化和抗血管損傷等[15-16]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)燈盞花乙素可促進PKG，尤其是PKG-Iα 表達，從而減輕人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞IR 損傷[5]，提示PKG 很可能是血管內(nèi)皮IR 損傷中的一種保護因素，促進其合成可能減輕IR 損傷。本研究觀察到PCI 組術(shù)后血清eNOS、亞硝酸鹽濃度（反映NO 量）和PKG 濃度均較非PCI 組顯著降低，提示ACS 患者進行PCI 操作較單純冠脈造影術(shù)明顯降低了血清eNOS、NO、PKG 濃度。而組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，PCI 組患者術(shù)后血清eNOS、亞硝酸鹽和PKG 濃度均較術(shù)前顯著降低，而非PCI組術(shù)后亞硝酸鹽濃度、PKG 濃度較術(shù)前均無明顯下降，雖然非PCI 組eNOS 濃度術(shù)后較術(shù)前降低，但PCI 組術(shù)后降低更顯著。PCI 組患者術(shù)前PKG濃度與術(shù)后FMD 具有正相關(guān)關(guān)系，提示PKG 可能對血管內(nèi)皮功能具有保護作用，PKG 水平高則血管內(nèi)皮損傷程度相對較輕。

ACS 患者進行PCI 治療后，由于PCI 引起的IR 損傷及機械損傷等原因，使血管內(nèi)皮功能受損；同時PCI 術(shù)后與內(nèi)皮依賴的血管舒張相關(guān)因子eNOS、NO、PKG 濃度也較術(shù)前明顯下降，提示ACS 患者PCI 術(shù)后血管內(nèi)皮損傷可能與eNOS、NO及PKG 的降低有關(guān)，eNOS/NO/PKG 信號通路可能參與ACS 患者PCI 術(shù)后血管內(nèi)皮保護作用。

本研究結(jié)果提示ACS 患者PCI 術(shù)可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能的損傷，其可能與eNOS/NO/PKG 信號通路有關(guān)，上調(diào)PKG 信號通路可能是拮抗PCI 術(shù)后血管內(nèi)皮損傷的治療靶點。但PKG 信號通路在ACS 患者PCI 術(shù)后致血管內(nèi)皮IR 損傷的具體作用機制，以及eNOS/NO/PKG 信號通路與血管內(nèi)皮功能之間的因果關(guān)系，還需更大樣本的臨床和實驗研究加以驗證。