部分蘋(píng)果屬種質(zhì)遺傳多樣性分析及分子身份證構(gòu)建

侯麗媛 ，董艷輝 ，鄧 舒 ，肖 蓉 ，張春芬 ，趙 菁 ，曹秋芬

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）果樹(shù)研究所，山西太原030031）

蘋(píng)果樹(shù)是世界上最重要的果樹(shù)之一，而我國(guó)是世界上最大的蘋(píng)果生產(chǎn)國(guó)，每年的蘋(píng)果出口量也位居世界前列。蘋(píng)果品質(zhì)資源復(fù)雜多樣，加之我國(guó)乃至世界各地的頻繁交流，很容易造成蘋(píng)果種質(zhì)的混雜，為了對(duì)蘋(píng)果種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)，有必要對(duì)蘋(píng)果品種資源進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，這也是對(duì)蘋(píng)果種質(zhì)資源保存和利用的前提，更是對(duì)其進(jìn)行知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的必要手段。

SSR 標(biāo)記是特異性強(qiáng)的一類分子標(biāo)記技術(shù)，具有共顯性、豐富的多態(tài)性、高度重復(fù)性及可靠性，同時(shí)操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)應(yīng)用非常廣泛[1]，是構(gòu)建指紋圖譜比較理想的分子標(biāo)記[2-3]。熒光SSR 分子標(biāo)記技術(shù)是在SSR 分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的和熒光測(cè)序技術(shù)有效結(jié)合的一種新技術(shù)。其具有高度智能化特點(diǎn)，這種標(biāo)記利用測(cè)序儀對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，不僅效率高而且靈敏度和準(zhǔn)確性好，同時(shí)還避免了人工判讀條帶帶來(lái)的誤差。目前，熒光SSR 分子標(biāo)記已被應(yīng)用于許多園藝植物研究中[4-5]，而且國(guó)內(nèi)外園藝植物DNA 分子身份證研究方面已取得了許多進(jìn)展[6-11]。

本研究通過(guò)對(duì)選取的山定子和我國(guó)華北地區(qū)種植面積相對(duì)較大的25 份蘋(píng)果栽培品種作為試驗(yàn)材料，運(yùn)用熒光SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)供試材料進(jìn)行分子鑒定，并在此基礎(chǔ)上對(duì)供試材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，同時(shí)建立了各供試材料的指紋圖譜和分子身份證，并在分子水平對(duì)山定子作為最常用蘋(píng)果砧木進(jìn)行了驗(yàn)證，旨在為蘋(píng)果種質(zhì)資源的利用與知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

為保證供試材料的可靠性，本研究選用的試驗(yàn)材料均取自國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)興城蘋(píng)果圃，包括砧木系材料1 份（山定子），栽培品種25 份，其中，美國(guó)育成品種11 份、日本育成品種7 份、我國(guó)育成品種6 份、加拿大育成品種 1 份（表 1）。

表1 26 份供試材料來(lái)源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA 提取和引物合成 采用德國(guó)QIAGEN 的 DNeasy Plant Mini Kit 的 DNA 試劑盒提取供試材料春季嫩葉基因組DNA。

表2 16 對(duì)熒光標(biāo)記SSR 引物及退火溫度

SSR 引物序列選擇擴(kuò)增片段長(zhǎng)度100～300bp，結(jié)合 HOKANSON 等[12]、LIEBHARD 等[13]、YAMAMOTO 等[14-15]、GUILFORD 等[16]和高源等[17]報(bào)道的 SSR引物序列，同時(shí)參考高源等[18]報(bào)道的熒光標(biāo)記引物，在對(duì)大量蘋(píng)果品種鑒定的基礎(chǔ)上，共篩選出16 對(duì)熒光SSR 引物用于本試驗(yàn)（表2）。帶有6-FAMTM熒光標(biāo)記的5′端SSR正向引物和SSR 反向引物均由上海Sangon 公司合成。

1.2.2 試驗(yàn)程序 PCR 反應(yīng)體系和PCR 程序參照文獻(xiàn)[19]，并稍作修改。其中，PCR 反應(yīng)體系為 15 μL，包括模板DNA（20 ng/μL）3 μL、F-primer（2 μmol/L）1.5 μL、R-primer（2 μmol/L）1.5 μL、10×PCR Buffer（不含 Mg2+）1.5 μL、Mg2+（25 mmol/L）0.9 μL、dNTP（25 mmol/L）0.12 μL，Taq酶（5 U/μL）0.12 μL，ddH2O 6.36 μL。

PCR 程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 1 min，退火1 min（退火溫度因引物而異），72 ℃延伸2 min，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。

PCR 擴(kuò)增采用乙醇進(jìn)行純化，95 ℃變性5 min，在美國(guó)ABI 3730 基因測(cè)序儀上對(duì)純化后的SSR熒光標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測(cè)，并對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行收集。

1.2.3 核心引物篩選 在前期篩選出的16 對(duì)熒光SSR 引物中進(jìn)一步篩選出7 對(duì)SSR 核心引物用于分子身份證構(gòu)建。這7 對(duì)SSR 核心引物能對(duì)本研究選用的試驗(yàn)材料進(jìn)行有效的區(qū)分，其分別是GD142、GD147、GD162、CH01h01、CH01f02、H02d08、CH02d12。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

對(duì)ABI3730 基因測(cè)序儀上獲得的不同樣品的指紋數(shù)據(jù)（即不同樣品在每個(gè)SSR 位點(diǎn)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度）利用GeneMapper 3.0 軟件進(jìn)行分析。遺傳數(shù)據(jù)分析利用軟件GenAlEx 6.501 進(jìn)行，計(jì)算遺傳多樣性指標(biāo)多態(tài)性等位基因數(shù)（Na）、SSR 位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)（Ne）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）以及固定指數(shù)（F）等。

采用Jaccard 相似系數(shù)，對(duì)供試材料的SSR 數(shù)據(jù)應(yīng)用NTSYS-pc 2.10e 軟件進(jìn)行計(jì)算，得到相似系數(shù)矩陣，然后利用UPGMA（Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean）方法進(jìn)行聚類分析，從而構(gòu)建出供試材料基因型間的親緣關(guān)系樹(shù)狀圖。

利用PopGen 32 軟件對(duì)獲得的供試材料的指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到各熒光SSR 引物多態(tài)性，然后將每對(duì)引物獲得的等位基因從小到大按照順序進(jìn)行排序，并對(duì)排列的等位基因用阿拉伯?dāng)?shù)字從0開(kāi)始賦值，對(duì)供試材料在7 個(gè)SSR 位點(diǎn)獲得的等位基因按照賦值數(shù)字分別進(jìn)行編碼，即可獲得每份供試材料獨(dú)有的字符串。在此基礎(chǔ)上，將每份材料按照相同位點(diǎn)順序排列的編碼字符串利用條碼技術(shù)轉(zhuǎn)化成每份材料獨(dú)特的條碼標(biāo)識(shí)，即得到不同材料的分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析

16 對(duì)熒光SSR 位點(diǎn)的遺傳多樣性進(jìn)行特征分析，結(jié)果如表3 所示。

表3 16 對(duì)熒光SSR 位點(diǎn)的遺傳多樣性特征分析

對(duì)供試的26 份材料基因組DNA 在16 對(duì)熒光SSR 標(biāo)記的位點(diǎn)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，共得到139 個(gè)多態(tài)性等位基因，其中，多態(tài)性等位基因數(shù)在5（NH015a）和 11（CH05e03）之間，平均等位基因數(shù)（Na）為7.938，供試樣品在每個(gè)熒光SSR 位點(diǎn)產(chǎn)生2 個(gè)相同（表現(xiàn)為單峰）或不同（表現(xiàn)為雙峰）的等位基因數(shù)；有效等位基因數(shù)（Ne）在 2.711（GD147）和 6.563（GD142）之間，平均值為 4.123；觀察雜合度（Ho）在 0.654 和 0.962 之間，平均值為 0.802；期望雜合度（He）在0.631 和0.848 之間，平均值為0.743；無(wú)偏雜合度期望值（uHe）在 0.644 和 0.864之間，平均值為0.758；香濃多樣性指數(shù)（I）在1.147和1.977 之間，平均值為1.616；固定指數(shù)（F）平均值為 -0.082（表 3）。

2.2 指紋圖譜構(gòu)建

利用篩選出的16 對(duì)SSR 熒光引物對(duì)26 份供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，準(zhǔn)確獲得了不同材料在不同位點(diǎn)的等位基因片段大小以及相應(yīng)的毛細(xì)管電泳圖，即指紋圖譜（圖1）。每對(duì)SSR 引物的擴(kuò)增帶型為5～11 個(gè)，平均為 7.938 個(gè)。26 份蘋(píng)果種質(zhì)在 16 對(duì)熒光SSR 位點(diǎn)的指紋圖譜互不相同（表4），是各種質(zhì)的特定譜帶，獲得的指紋圖譜可以為種質(zhì)鑒定提供理論依據(jù)。

表4 26 份試材在16 對(duì)SSR 位點(diǎn)的指紋圖譜

續(xù)表4

2.3 聚類分析

根據(jù)16 對(duì)SSR 熒光標(biāo)記擴(kuò)增26 份蘋(píng)果種質(zhì)的標(biāo)記信息計(jì)算不同種質(zhì)間的相似系數(shù)，得到各材料的Jaccard 系數(shù)矩陣，并在此基礎(chǔ)上，利用UPGMA 對(duì)供試材料進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建出供試材料基因型間的親緣關(guān)系樹(shù)狀圖（圖2）。

26 份供試材料之間的Jaccard 相似系數(shù)分布在0.617 和 1.000 之間，平均值達(dá)到 0.805（表 5），說(shuō)明各供試材料之間在分子水平上親緣關(guān)系相對(duì)較近（圖2）。以相似系數(shù)0.617 為標(biāo)準(zhǔn)，可以明顯分為2 個(gè)類群，類群I 為山定子組，只有一個(gè)種質(zhì)——山定子；類群II 為蘋(píng)果組，包括除山定子以外的其他蘋(píng)果栽培品種。以相似系數(shù)0.680 為標(biāo)準(zhǔn)，蘋(píng)果栽培品種分為5 類。

表5 26份供試材料相似系數(shù)

2.4 分子身份證的建立

對(duì)26 份供試材料在7 對(duì)熒光SSR 位點(diǎn)獲得的指紋圖譜數(shù)據(jù)從小到大按順序進(jìn)行排列，并從0 開(kāi)始用阿拉伯?dāng)?shù)字進(jìn)行賦值，其結(jié)果列于表6。例如，熒光SSR 引物CH01f02 對(duì)供試材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增共獲得了10 個(gè)等位基因片段，其中，最小的等位基因片段為162 bp，最大的等位基因片段為206 bp，對(duì)未獲得等位基因的位點(diǎn)標(biāo)記為-9；先將等位基因片段按照從小到大順序排列，并從0 開(kāi)始賦值，即將最小等位基因片段162 bp 賦值為0，最大等位基因片段206 bp 賦值為10，這樣即得到了每份材料在熒光SSR 引物CH01f02 獨(dú)有的字符串。以金冠為例，在 7 個(gè)熒光 SSR 位點(diǎn) GD142、GD147、GD162、CH01h01、CH01f02、CH02d08 和 CH02d12 獲得的等位基因分別為 142、135、214/233、116/118、170/179、225/225、220/232 bp，其對(duì)應(yīng)的賦值分別為 6、4、0/5、3/4、1/9、4/5 和 3/6，按照排列獲得的字符串即為66440534134536。然后再將字符串利用條形碼技術(shù)轉(zhuǎn)化成獨(dú)特的條形碼標(biāo)識(shí)即為分子身份證（表7）。

表6 等位基因的賦值標(biāo)準(zhǔn)

表7 供試材料的分子身份證

3 討論

3.1 構(gòu)建分子身份證的意義

種質(zhì)資源是親代傳遞給子代基因的載體，是種質(zhì)創(chuàng)新和培育作物新品種的原始材料。種質(zhì)資源的研究對(duì)于種質(zhì)資源的利用效率、作物育種和生產(chǎn)發(fā)展的水平具有一定的意義[20]。在蘋(píng)果種質(zhì)資源方面，一方面隨著各地蘋(píng)果種質(zhì)資源的頻繁交流，造成了種質(zhì)混雜現(xiàn)象層出不窮；另一方面隨著蘋(píng)果新品種的選育和推廣，急需對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定和保護(hù)。種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒定為知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)及利用提供了保障。指紋圖譜數(shù)字化后的結(jié)果即為分子身份證，各品種的分子身份證可以通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行自動(dòng)比對(duì)，更高效、方便和準(zhǔn)確。另外，分子身份證能夠簡(jiǎn)單明了地區(qū)分品種間的差異，可以在大規(guī)模品種比對(duì)中廣泛使用。

3.2 遺傳多樣性分析

本研究利用16 對(duì)熒光SSR 引物在26 份材料中共擴(kuò)增出139 個(gè)多態(tài)性等位基因，多態(tài)性等位基因數(shù)在 5（NH015a）和 11（CH05e03）之間，平均等位基因數(shù)（Na）為7.938；供試樣品在每個(gè)熒光SSR 位點(diǎn)產(chǎn)生2 個(gè)相同（表現(xiàn)為單峰）或不同（表現(xiàn)為雙峰）的等位基因數(shù)；有效等位基因數(shù)（Ne）在2.711（GD147）和 6.563（GD142）之間，平均值為 4.123；觀察雜合度（Ho）在0.654 和0.962 之間，平均值為0.802；期望雜合度（He）為 0.631～0.848，平均值為0.743；無(wú)偏雜合度期望值（uHe）在 0.644 和 0.864之間，平均值為0.758。

一般認(rèn)為，沒(méi)有經(jīng)過(guò)高強(qiáng)度的人工選擇，遺傳多樣性較高的種群雜合度高于0.5[21]。本研究中，觀察雜合度、期望雜合度和無(wú)偏雜合度期望值均高于0.5，說(shuō)明材料間遺傳多樣性相對(duì)較高。固定指數(shù)也稱為近交系數(shù)，是群體中雜合子頻率差異的估計(jì)值，是用來(lái)衡量群體是否隨機(jī)交配的重要指標(biāo)，通過(guò)雜合子頻率偏差反映群體在某個(gè)位點(diǎn)的遺傳分化程度[22]。本研究中，26 份蘋(píng)果屬材料在16 對(duì)熒光SSR位點(diǎn)檢測(cè)固定指數(shù)，平均值為-0.082，結(jié)果顯示，供試材料之間雜合子缺陷度不高，同時(shí)也表明Hardy-Weinberg 平衡的偏離程度不大。固定指數(shù)在5 個(gè)SSR 位點(diǎn)為正值，說(shuō)明在一定程度上雜合子缺乏，純合子過(guò)量，材料間存在近交現(xiàn)象；在11 個(gè)SSR位點(diǎn)為負(fù)值，在位點(diǎn)Ch02d12 雜合頻率最高，表明供試材料在該位點(diǎn)的雜合性較為豐富。

3.3 聚類分析結(jié)果

從分子水平上來(lái)說(shuō)，遺傳相似系數(shù)越小，種質(zhì)間的遺傳分化越大，遺傳多樣性也越高。本研究中，26 份供試材料之間的Jaccard 相似系數(shù)分布在0.617 和1.000 之間，平均值達(dá)到了0.805。相似系數(shù)越大，表明所選品種間的遺傳關(guān)系越近，遺傳多態(tài)性偏低，遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄。

以相似系數(shù)0.617 為標(biāo)準(zhǔn)，可以明顯分為2 個(gè)類群，類群I 為山定子組，只有一個(gè)種質(zhì)（山定子）；類群II 為蘋(píng)果組，包括除山定子以外的其他25 個(gè)蘋(píng)果栽培品種。這一結(jié)果僅就山定子和其他蘋(píng)果栽培品種來(lái)說(shuō)，山定子和其他蘋(píng)果組材料之間遺傳相似系數(shù)相對(duì)較低，二者間親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，另一方面就遺傳相似系數(shù)來(lái)說(shuō)，數(shù)值越大表明親緣關(guān)系越近。本研究結(jié)果在相似系數(shù)0.617 處分為2 個(gè)類群，也表明山定子和蘋(píng)果組種質(zhì)間的遺傳分化不是太大。山定子為我國(guó)蘋(píng)果生產(chǎn)中經(jīng)常使用的野生蘋(píng)果砧木，與蘋(píng)果嫁接親和性高，說(shuō)明蘋(píng)果栽培品種與山定子間嫁接親和性的差異與遺傳信息確實(shí)有關(guān)，從而可以在分子水平上解釋為什么山定子被作為最為常用的蘋(píng)果砧木的原因。

以相似系數(shù)0.680 為標(biāo)準(zhǔn)，蘋(píng)果栽培品種分為5 類，II-1 組只包括舞美一個(gè)品種，其為芭蕾蘋(píng)果的一種、蘋(píng)果中的極矮化品種，是英國(guó)東茂林試驗(yàn)站從威賽克旭（McIntosh wijeik）自然實(shí)生苗中選育的柱型蘋(píng)果，與其他普通型蘋(píng)果之間親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)；II-2 組只有祝光，其是美國(guó)古老品種之一、實(shí)生選種，早熟；II-3 組是蜜脆，其為美國(guó)品種，中熟，由Macoun×Honeygold 雜交選育而來(lái)。這一結(jié)果進(jìn)一步證明，舞美、祝光和蜜脆與其他蘋(píng)果栽培品種之間遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。II-4 組包括其余的22 個(gè)蘋(píng)果品種，在II-4 組中分為兩大組，其中，II-4-1 組中以相似系數(shù)0.797 為標(biāo)準(zhǔn)，初秋、旭和王林聚在一起，初秋是從紅玉和金冠的雜交種中選育而來(lái)的；旭原產(chǎn)于加拿大，實(shí)生選種；王林是從金冠實(shí)生苗中選育而來(lái)的。說(shuō)明它們之間相對(duì)遺傳距離較近。在相似系數(shù)0.781 處，千秋、秋紅嘎拉、宮藤富士、長(zhǎng)富1 號(hào)、北海道9 號(hào)、寒富、國(guó)光聚在一組，其中，千秋由東光（金冠×印度）×富士（國(guó)光×元帥）雜交而來(lái)；秋紅嘎拉是嘎拉（（元帥×桔蘋(píng)）×金冠）的芽變；宮藤富士、長(zhǎng)富1 號(hào)、寒富都是富士（國(guó)光×元帥）芽變；北海道9 號(hào)是從富士（國(guó)光×元帥）×津輕的雜交后代中選育而來(lái)的，在這一組中富士系都聚在了一起。以相似系數(shù)0.836 為標(biāo)準(zhǔn)，紅星、元帥、金矮生和青香蕉聚在一起，紅星蘋(píng)果為元帥的芽變品種；金矮生是金冠的短枝芽變；青香蕉由實(shí)生選育而來(lái)。上述品種中除旭和青香蕉之外都有元帥和金冠的血緣，親緣關(guān)系相對(duì)較近，而旭和青香蕉都是古老品種，由實(shí)生選育而來(lái)，說(shuō)明這2 個(gè)早期的蘋(píng)果實(shí)生品種的來(lái)源很相近。II-4-2 組，在相似系數(shù)0.828 處，津輕、金冠、丹霞、喬納金和秦冠聚為一組，其中，津輕為金冠的自然雜交種；丹霞是由金冠實(shí)生苗選育而來(lái)，喬納金是金帥（金冠）×紅玉的雜交種；秦冠是從金冠×雞冠的雜交種中選育而來(lái)，在這一組中，津輕、丹霞、喬納金和秦冠都含有金冠的血緣，從遺傳學(xué)角度來(lái)說(shuō)更多地保留了金冠的遺傳特性。在相似系數(shù)0.750 處，紅玉、錦玉和中秋聚在一起，紅玉為可口香的實(shí)生后代，原產(chǎn)于美國(guó)；錦玉是紅玉的芽變；中秋是紅玉和元帥的雜交種，中秋更多保留了紅玉的遺傳特性；錦玉和中秋都含有紅玉的血緣。因此，紅玉、錦玉和中秋聚在了一起。

從聚類圖中還可以看出，以相似系數(shù)1.000 為標(biāo)準(zhǔn)，金冠和丹霞聚在了一起，丹霞是從金冠實(shí)生苗選育而來(lái)的。這一結(jié)果也顯示，二者之間的親緣關(guān)系很近，基本不存在差異。如果想對(duì)這些材料進(jìn)行區(qū)分只能增加引物數(shù)量，以進(jìn)一步篩選二者間多態(tài)性的引物，尋找之間的差異。

本研究所用試材的大部分分類結(jié)果與已知蘋(píng)果品種間的譜系較為一致，絕大部分系譜相同或相近的品種聚在一起，與HOKANSON 等[23]的試驗(yàn)結(jié)果相近。

4 結(jié)論

本研究以山定子和我國(guó)華北地區(qū)種植面積相對(duì)較大的25 份蘋(píng)果栽培品種為供試材料，在進(jìn)行分子鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)供試材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，同時(shí)建立了各供試材料的指紋圖譜和分子身份證，在分子水平對(duì)山定子作為最常用蘋(píng)果砧木進(jìn)行了驗(yàn)證。該研究對(duì)于有效地利用和保護(hù)這些種質(zhì)資源具有重要的參考價(jià)值，同時(shí)也提示育種者在育種工作中要盡量擴(kuò)大選擇范圍，引入新的種質(zhì)，促使種群間的基因交流和重組，以提高后代的品質(zhì)。