Box-Behnken響應面法優化黃柏鹽酸小檗堿的提取工藝

胡玲玲

(安康學院 化學化工學院， 陜西 安康 725000)

黃柏(Cortexphellodendri )是由蕓香科黃檗屬落葉喬木黃檗或黃皮樹(PhellodendronchinenseSchneid)的干燥樹皮制成。是我國傳統的中藥材之一，藥用價值很高，生用性寒苦，能清熱解毒，治療熱毒瘡瘍等[1-3]，也可經炮制使用。現代藥理學研究表明，黃柏具有與黃連相似的抗病原微生物作用[4]，其提取物中含有多種生物堿，如小檗堿、黃柏堿、巴馬亭、藥根堿、木蘭花堿等。這些生物堿有降壓利膽、抗潰瘍、鎮靜等作用[5-7]。鹽酸小檗堿是黃柏提取物中的主要有效成分之一，具有廣譜的抗菌活性。黃柏小檗堿的傳統提取方法有石灰乳法、酸水法和醇提法等。近年來發展的酶輔助法和超聲輔助法[ 8-10]避免了高溫引起的藥物活性成分結構的變化，且具有省時、節能的特點。試驗采用響應面分析法[11-14]，研究超聲輔助提取不同因素對提取率的影響，優化超聲輔助法提取黃柏小檗堿的工藝，提高其提取率，以期為黃柏的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材 黃柏：購自于安康市藥材公司。

1.1.2 試劑 無水乙醇(AR) ，天津市天力化學試劑有限公司； 鹽酸小檗堿對照品，上海源葉生物科技有限公司；濃鹽酸(AR)， 天津市東麗區新中村； 去離子水，實驗室自制。

1.1.3 儀器 L5S紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；KQ2200E型超聲波清洗儀(40 kHz，250 w)，昆山市超聲儀器有限公司；中草藥粉碎機(FW177型)， 天津市泰斯特儀器有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋，上海科偉永興儀器有限公司；FD-1A-80臺式冷凍干燥機，上海予騰生物科技有限公司； 電子分析天平(AE224)，舜宇恒平儀器。

1.2 方法

1.2.1 鹽酸小檗堿標準曲線的繪制 用電子分析天平(AE224)稱取鹽酸小檗堿對照品20 mg，加熱溶解，容量瓶中定容至100 mL，配制成0.2 mg/mL的鹽酸小檗堿的儲備液。用吸量管分別吸取儲備液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL于25 mL的容量瓶中，用去離子水定容，制成系列濃度的鹽酸小檗堿對照品溶液。用去離子水做空白對照，用紫外分光光度計掃描波長，345 nm處有最大吸光度。故在波長345 nm處測定對照品溶液的吸光度[15-16]。分別以吸光度和鹽酸小檗堿濃度為縱坐標和橫坐標，得到回歸方程y=0.009 6x+0.184 4 ；R2=0.999 2。鹽酸小檗堿濃度在4～40 μg/mL線性關系良好。

1.2.2 鹽酸小檗堿的提取和提取率的計算 將黃柏用中藥粉碎機粉碎，過16目篩，精密稱取黃柏粉末5 g于具塞錐形瓶，加入一定量的提取溶劑，浸泡24 h，設定提取的超聲溫度和超聲時間。提取液趁熱抽濾，旋轉蒸發至粘稠狀態后轉移至100 mL的容量瓶中用去離子水定容，吸量管吸取1 mL溶液并稀釋至100 mL，在波長345 nm處分別測其吸光度并計算鹽酸小檗堿的提取率。

式中，C為鹽酸小檗堿濃度(μg/mL)；V為濃縮液定容體積；n為稀釋倍數；m為黃柏粉末的質量(g)。

1.2.3 單因素試驗

1) 超聲時間。以HCl-70%乙醇(1∶100)為提取溶劑，液料比30∶1(mL∶g，下同)，超聲溫度60℃，分別超聲提取20 min、30 min、40 min、50 min和60 min，取其濾液，定容稀釋、測定吸光度并計算鹽酸小檗堿的提取率。

2) 超聲溫度。以HCl-70%乙醇(1∶100)為提取溶劑，液料比30∶1，分別在30℃、40℃、50℃、60℃和70℃的條件下超聲提取50 min，取其濾液，定容稀釋、測定吸光度并計算鹽酸小檗堿的提取率。

3) 乙醇濃度。液料比30∶1， 超聲溫度60℃，超聲提取時間50 min,分別以HCl-50%乙醇、HCl-60%乙醇、HCl-70%乙醇、HCl-80%乙醇及HCl-90%乙醇(1∶100)為提取溶劑進行超聲處理，取其濾液，定容稀釋、測定吸光度并計算鹽酸小檗堿的提取率。

4) 液料比。用HCl-70%乙醇(1∶100)為溶劑，液料比分別為10∶1、20∶1，30∶1、40∶1、50∶1，超聲溫度60℃，超聲提取50 min，取其濾液，定容稀釋、測定吸光度并計算鹽酸小檗堿的提取率。

1.2.4 響應面試驗 在單因素試驗的基礎上，篩選出影響鹽酸小檗堿提取較顯著的3個因素采用Design-Expert 8.0.6，結合Box-Benhnken的中心試驗原理，進行響應面試驗。其因素水平見表1。

表1 黃柏鹽酸小檗堿提取的響應面因素及水平

1.3 數據分析

采用Design Expert8.0.6對數據進行處理及分析，建立回歸方程。

2 結果與分析

2.1 不同因素對黃柏鹽酸小檗堿提取率的影響

從圖1可知不同超聲時間、超聲溫度、料液比及乙醇濃度條件下黃柏鹽酸小檗堿的提取率。

2.1.1 超聲時間 黃柏鹽酸小檗堿的提取率隨超聲時間延長呈上升趨勢，在50～60 min雖為增長趨勢，但增幅降低。提取率趨于平穩，可能是因為超聲時間增長使得破壁更碎，雜質析出更多，與小檗堿競爭溶于提取液，使得鹽酸小檗堿的提取率增幅減緩。故選擇超聲提取時間為40 min。

2.1.2 超聲溫度 隨著溫度的升高，黃柏鹽酸小檗堿的提取率也快速上升。60℃時，提取率最大，為6.68%。隨著溫度的繼續上升提取率呈下降趨勢。這可能是因為隨著溫度的升高，鹽酸小檗堿的結構在超聲條件下，隨著溫度的提高受到了破壞，表現出提取率下降。故選擇超聲提取的溫度為60℃。

2.1.3 液料比 隨加入提取溶劑量的增多，黃柏鹽酸小檗堿的提取率呈先升后降趨勢。在30∶1時提取率最大，為6.46%。故選擇液料比為30∶1。

2.1.4 乙醇濃度 隨提取液乙醇濃度的增大，黃柏鹽酸小檗堿的提取率呈先升后降趨勢，當溶劑中乙醇濃度為70%時，黃柏鹽酸小檗堿提取率最大，為6.38%。推測可能是鹽酸小檗堿的極性與70%的乙醇的極性相似，所以溶解度最大。故選擇提取溶劑的乙醇濃度為70%。

2.2 響應面試驗優化黃柏鹽酸小檗堿提取工藝

2.2.1 回歸模型的建立 從表2可知不同處理的黃柏小檗堿提取率。對數據進行擬合分析得線性回歸方程模型：Y=6.75+0.064A-0.047B+0.23C-0.19AB+0.020AC-0.0075BC-0.55A2-0.30B2-0.76C2。方差分析表明，該回歸模型P<0.000 1，該模型極顯著；且失擬值項中P=0.611 4，不顯著；R2=0.995 7，RAdj2=0.990 3，表明該模型可靠。方差分析表明，超聲時間P=0.014 9(<0.05)，料液比P<0.0001。各因素對提取率的影響依次為C(液料比)>A(超聲時間)>B(超聲溫度)。

表2 響應面試驗各處理的黃柏鹽酸小檗堿提取率

2.2.2 不同因素的交互作用 從圖2可知，液料比和超聲時間的響應曲面較陡，表明液料比和超聲時間對黃柏鹽酸小檗堿提取率的影響顯著；超聲溫度和料液比的曲面相對較平緩，說明超聲溫度和料液比對提取率的影響不顯著，與方差分析結果一致。超聲時間和超聲溫度的等高線呈明顯的橢圓形，響應面曲線較陡，表明超聲時間和超聲溫度間的交互作用較強，且方差分析結果中，交互項AB的P=0.000 3(<0.01)，也說明超聲時間和超聲溫度因素間存在顯著的交互作用。液料比與超聲時間，液料比與超聲溫度的等高線不呈明顯的橢圓形，表明交互作用不明顯，與方差分析結果一致(AC項和BC項P>0.05)。

2.2.3 最佳提取條件的確定 根據Box-Behnken試驗設計所得的結果和回歸方程，預測超聲波輔助提取黃柏鹽酸小檗堿的最優工藝為超聲時間40.77 min，超聲溫度58.95℃，液料比為31.54∶1(mL∶g)，該條件下，預測黃柏鹽酸小檗堿的提取率為6.77%；考慮到實際操作，將最佳提取工藝修正為超聲時間40 min，超聲溫度59℃，液料比30∶1(mL∶g)，經3次平行測試，黃柏鹽酸小檗堿的提取率為6.73%，與預測值的相對誤差為0.59%，說明，該工藝可靠。

3 小結

以HCL-70%乙醇(1∶100)為溶劑，對超聲輔助提取黃柏鹽酸小檗堿的工藝優化結果表明，最佳提取工藝為超聲時間40 min，超聲溫度59℃，液料比為30∶1(mL∶g)，在該條件下，黃柏鹽酸小檗堿的提取率較高，為6.73%。