丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對大鼠油酸致急性肺損傷纖維化的干預效應研究

劉志平，李粉英，黃 桑，羅 力，陳遠彬，何光范，曾昭智

[1.廣東藥科大學附屬第二醫院(廣州新海醫院)，廣東 廣州 510300；2.廣東省中醫院，廣東 廣州 510120；3.廣東藥科大學實驗動物中心，廣東 廣州 510006]

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種急性的重癥，在臨床并不少見。造成ALI的原因很多，根本原因是肺泡毛細血管的細胞膜因為某些原因通透性增高，往往導致重癥監護患者短時間內死亡。現有研究表明[1-5]，在患者的肺內發生了多種由炎性因子和炎性細胞浸潤的反應，這些反應在肺泡上皮細胞等作用下被逐級放大，炎性反應也由此更為嚴重。而細胞因子本身的作用又是通過網絡發揮作用的，具有協同性和疊加性。現在已經有了大量研究證明，ALI早期患者的肺中已經出現了纖維化，這種纖維化的程度又直接影響了病情進展，甚至能夠影響預后。因此，通過研究ALI中的炎性因子了解ALI纖維化是怎樣發生的，以及怎樣或采取何種藥物進行干預，終極目的在于更好地治療ALI，抑或是開辟預防ALI新途徑。遺憾的是目前并沒有特效藥物可以針對ALI進行良好的治療。本研究選擇的藥物是丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉，以期從中國傳統藥物中尋找思路，使用大鼠與油酸，將大鼠誘導出現急性肺損傷纖維化之后再采用藥物進行干預，采大鼠血液檢查白細胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和Ⅲ型前膠原(PCⅢ)，探討其可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1實驗資料

1.1.1藥物與試劑：丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉注射液(上海上藥第一生化藥業有限公司，批號：1603102)，IL-1、TNF-α、PCⅢ ELISA檢測試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司，批號：201705)，油酸(天津市致遠化學試劑有限公司，批號：2016110142)，10%中性福爾馬林(廣州化學試劑廠，批號：20150303)。

1.1.2儀器：FA2004B電子天平(上海精科天美)，HZT-A1000電子天平(廈門華志)，RM2235切片機(德國徠卡)，AE2000倒置顯微鏡(廈門麥克奧迪)、HCP246恒溫培養箱(德國Memmert)，3K15冷凍離心機(德國SIGMA)，Infinite 200 pro酶標儀(瑞士tecan)，血氣分析儀(美國 ABBOTT 公司)，Forma 902超低溫冰箱(美國Thermo)。

1.1.3動物：本研究所用的均為雄性SD大鼠[由南方醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(粵)2012-1125，合格證號SCXK(粵)2016-0041]，180～220 g購買好實驗用大鼠后，先將之飼養在屏障環境中。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2方法

1.2.1建立ALI 大鼠模型：全部大鼠共66只，將油酸一次性從尾靜脈注射進入大鼠體內，12 h后從大鼠的尾動脈中取約0.2 ml血液監測氧合指數，若達到PaO2/FiO2≤300就說明造模成功，進行下一步工作。

1.2.2分組及各自的處理：取沒有注射油酸的24只大鼠，自尾靜脈中注射與造模組等量的生理鹽水作為對照組。另外在建模成功的大鼠中選取48只，隨機平均分成兩組，其中一組為模型組，另一組為丹參酮治療組，在這兩組小鼠腹腔中以2 ml/kg的量注射生理鹽水。丹參酮治療組腹腔注射丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉注射液10 mg/kg，連續14 d每天進行一次注射。于停藥第7天隨機處死12只大鼠，第14天時再次處死余下的12只，取相應部位樣品檢測。

1.3觀察指標：體重測定：給藥前、停藥第7天、停藥第14天。血氣分析樣品：大鼠動脈血，時間：給藥前、停藥第7天、停藥第14天。指標：PaO2、PaO2/FiO2。肺指數、肺組織濕/干重測定時間：停藥第7天、停藥第14天；樣本：大鼠全肺，計算公式：肺指數=肺重(mg)/體重(g)。干重處理溫度：60 ℃，干重處理時間：72 h；濕/干質量比(W/D)計算目的：肺水腫程度。用大鼠左肺。肺組織病理:停藥第7天、停藥第14天。固定液：10%福爾馬林；樣本：大鼠的右肺上葉，石蠟包埋切片后染色鏡檢。主要觀察指標：肺泡水腫、間質水腫、出血、肺不張、肺壞死、炎性細胞浸潤、肺充血、纖維化等。

1.4血清TNF-α、PCⅢ以及IL-1 含量測定：分別于停藥第7天和第14天大鼠動脈采血3 ml，1 000 r/min離心10 min，分離取用血清，ELISA法測定TNF-α、PCⅢ以及IL-1水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書要求進行操作。

2 結果

2.1丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對ALI大鼠體重的影響：丹參酮治療組的大鼠體重與其他兩組在停藥7 d和14 d后，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。提示丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉ALI大鼠體重無明顯影響。

表1 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對ALI大鼠體重的影響

2.2丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療處理后ALI大鼠血液PaO2及PaO2/FiO2結果變化：模型組及丹參酮治療組給藥前PaO2及PaO2/FiO2結果值均明顯低于正常對照組，證明ALI大鼠成功造模。停藥7 d和14 d后，丹參酮治療組與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，明顯高于模型組大鼠，見表2。

表2 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對ALI大鼠血液PaO2及PaO2/FiO2結果變化情況

2.3丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療處理后ALI大鼠的肺指數、濕/干重比變化情況：停藥7 d和14 d后，正常對照組肺指數及濕/干重比均有不同程度降低，丹參酮治療組肺指數及濕/干重比均有不同程度降低，對比模型組而言，部分結果差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對ALI大鼠肺指數以及濕/干重比變化情況

2.4病理學結果

2.4.1肉眼觀察結果：模型組有肺水腫，肺表面出現血紅病變等癥狀，并且體積增大。丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉干預后，血紅病變減少，水腫等接近正常組。

2.4.2光鏡觀察結果：正常組肺泡腔無損壞，未見肺泡炎細胞、肺水腫、支氣管上皮變形、管周炎和支氣管纖維化。模型組鏡下未見肺泡腔，肺泡壁鏡下明顯增厚，可見較多炎細胞，可見明顯肺水腫，支氣管上皮嚴重變形，可見明顯纖維增生伴有肺結構破壞。丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療后可見明顯的肺水腫好轉，支氣管變形情況消失，炎細胞明顯減少，纖維化程度大幅減輕，見圖1。

A：正常對照組：HE ×100

2.5丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對ALI大鼠血液TNF-α、PCⅢ以及IL-1 水平的影響：正常對照組和丹參酮治療組大鼠，相比模型組，在停藥7 d和14 d后，外周血中IL-1、TNF-α、PCⅢ水平均有所降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對ALI大鼠外周血中IL-1、TNF-α、PCⅢ水平的影響

3 討論

用油酸來制作ALI模型是得到了廣泛應用的ALI研究模型之一，建模容易成功，結果過以滲出、炎性反應和纖維增殖階段為特點[6-8]，早期即可觀察到肺纖維化。

本研究給大鼠注射了一定量的油酸，誘發了大鼠的肺充血水腫，出現炎性反應，肺泡壁增厚，大量炎細胞浸潤，并且發生明顯的肺損傷和纖維化，這些變化是對臨床上ALI纖維化進程中病理變化的良好模擬。從PaO2/FiO2≤300及肺水腫、肺指數等指標來看，造模后的大鼠都明顯高于正常對照[9]，表明進行了成功的造模成功。經丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療，可見明顯的肺水腫好轉，支氣管變形情況消失，炎細胞明顯減少，纖維化程度大幅減輕，同時能提高動物血液中PaO2、PaO2/FiO2指數。

ALI纖維化過程中炎性變化有重要意義，IL-1、TNF-α等炎性因子促使大量中性粒細胞聚集于肺組織中，它們一般都黏附于肺毛細血管內皮細胞上，誘發細胞釋放蛋白酶、氧自由基等，并且釋放更多炎性介質等，損傷細胞，這些就是肺纖維化的病理基礎，由此可能發生的不僅僅是肺組織中毛細血管通透性增高，使得肺泡液伴隨大量蛋白質滲出，還可能形成透明膜。PCⅢ是膠原纖維所特有的，可以用作機體組織纖維化的標志物，其含量的變化與膠原的形成代謝有一定的相關性，因此用以判斷組織纖維化程度。本實驗發現在油酸誘導的ALI纖維化模型中TNF-α、PCⅢ以及IL-1 大量表達，再次證明了先前國內外相關文獻研究成果[10-11]，經丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療后，上述三種因子的水平顯著降低，可以解釋為丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉能夠有效保護ALI纖維化油酸大鼠肺模型，其方式有二，一是直接減少IL-1、TNF-α，二是通過降低PCⅢ，從而減少膠原蛋白沉積在細胞外基質中，從而達到防治ALI纖維化的作用[12]。但本研究并沒有進行信號通路的研究，所以也無法解釋到底哪種調節機制在疾病的形成中發揮了作用，因此需要后期實驗室中更加完善的設計和更深入的研究來進行說明。

綜上所述，丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉在某種程度上能夠有效治療油酸模型大鼠ALI纖維化，作用機制可能涉及了炎性因子的調節作用。但其對炎性因子水平調節機制和對信號通路的影響需做更進一步的研究。