mNGS在中樞神經系統感染中的診斷效能評估

李 霞，譚少華，韓 孟，葉明欣，李少梅

(廣州市番禺區中心醫院，廣東 廣州 511400)

中樞神經系統感染性疾病是一種常見的神經系統感染性的急危重癥，具有潛在的致死性，并且在世界范圍內具有較高的發病率和死亡率。其致病微生物眾多，包括細菌、病毒和真菌以及寄生蟲等，疾病的臨床表現往往呈現非特異性，如果不能及時識別其致病病原體并給予針對性的治療，則會導致患者的病情迅速發展為持續高熱、癲癇、昏迷甚至死亡。因此，在中樞神經系統感染性疾病的診治過程中，病原體的明確起著至關重要的作用[1]。迄今為止，對中樞神經系統感染的診斷依然面臨著很大的挑戰，其臨床癥狀多種多樣，且感染癥狀與非感染癥狀常常發生重疊，給準確診斷造成了很大困難。在既往的臨床診治過程中，臨床醫生只能通過腦脊液常規、生化、培養等結果判定患者可疑的病原體種類，2013年，美國C.Y.Chiu教授首次應用mNGS技術診斷了14歲小男孩的鉤端螺旋體腦病并挽救了他的生命，引起了全球神經科醫生對mNGS技術在病原體檢測方面應用的巨大興趣，并進行了探索性研究[2]。近年來，既往的研究宏基因組測序在神經系統感染中的應用多以個案報道為主，依然不能評估mNGS在神經系統感染中的診斷價值。本研究對疑似中樞神經系統感染分別行腦脊液mNGS檢測和常規培養檢測，并對相關結果進行對比分析，以明確mNGS可以為臨床神經科感染性疾病的精準治療提供可靠的工具，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2019年1月～2019年12月就診于我院的疑似中樞神經系統感染的39例患者為研究對象，男21例，女18例，年齡15～88歲，平均(39.9±5.7)歲。所有患者均簽署了知情同意書。根據2016年《細菌性腦膜炎診治指南》[3]，納入發熱、頭痛、癲癇、精神狀態改變、記憶力下降，腦膜刺激征陽性，或影像學提示腦炎腦膜炎的可能的患者。

1.2方法：觀察組行mNGS檢測：進行樣本采集與mNGS檢測，每名患者采集約2～3 ml腦脊液樣本，并進行無菌密封，于-20℃儲存或干冰冷鏈物流運輸至予果生物科技有限公司(中國,北京)，按照DNA提取、文庫構建，在Illumina平臺上運行宏基因組二代測序，然后進行數據分析。首先運用通過過濾掉原始數據中低質量序列和短序列(長度<50 bp)得到高質量測序數據，再運用SNAP軟件去除人類基因，最后通過Burrows-Wheeler同時與微生物基因組數據庫進行比對，從而對序列分類，數據庫來源于NCBI，包括超過20 000種微生物，覆蓋了與人類疾病相關的11 910種細菌、7 103種病毒、1 046種真菌和305種寄生蟲的基因組。

對照組行常規培養檢測：采集約4～6 ml腦脊液樣本，將其接種在厭氧菌、需氧菌培養基中進行培養，控制二氧化碳濃度在6%～11%，溫度控制在35～36℃，18～24 h后進行觀察，分析是否有增菌液渾濁現象或菌膜組織，提取培養液或菌膜，接種在血平板中，進行病原體的分離培養，然后開展離心處理工作，涂片干燥之后，進行革蘭染色鏡檢檢驗。

1.3觀察指標：①診斷符合率：患者以患者急性起病，以頭痛、發熱、昏迷、抽搐、精神行為異常等為主要臨床表現，查體提示腦膜刺激征陽性，腦脊液壓力正常或升高，腦脊液白細胞計數升高，臨床抗感染治療后有效，考慮診斷中樞神經系統感染明確。統計觀察組mNGS陽性、陰性與臨床診斷相符合例數，對照組常規腦脊液培養陽性、陰性與臨床診斷相符合例數。②統計觀察組mNGS組和對照組常規腦脊液培養組靈敏度、特異度、一致性。

1.4統計學處理：所有數據均由SPSS 18.0軟件處理，計數資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗及Fisher's 檢驗，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1兩組診斷符合率比較：39例患者中，觀察組mNGS陽性、陰性與臨床診斷相符合總例數29例，對照組常規腦脊液陽性、陰性與臨床診斷相符合總例數13例，觀察組診斷符合率明顯高于對照組，差異有統計學意義(χ2=11.61，P<0.001)。

2.2兩組靈敏度、特異度、一致性：mNGS組有16例患者mNGS結果為陽性，靈敏度為61.54%，特異度100%，一致性為74.36%。常規腦脊液培養所有39例疑似病例均為陰性結果；常規腦脊液培養的靈敏度為0，特異度100%，一致性為33.3%。觀察組靈敏度、特異度、一致性均明顯高于對照組，見表1。

表1 兩組靈敏度、特異度、一致性比較(%)

3 討論

對入組的疑似中樞神經系統感染的患者的腦脊液進行宏基因組檢測，以對mNGS在中樞神經系統感染的診斷效能進行評估。

既往對病原體的診斷較多的依靠腦脊液的常規、生化、培養、鏡檢，近年來還有基于PCR的病原特異性核酸檢測。但腦脊液的培養、鏡檢的陽性率比較低，無法早期或者超早期給與臨床指導，腦脊液的常規、生化經常會受到患者的病程或者抗生素的應用而產生非特異性的表現[4]。所以在臨床診治過程中，臨床醫生基本要綜合患者的臨床特點、腦脊液常規、生化結果進行可能性的診斷，比如劃分為病毒性、細菌性、真菌性等，無法得到明確的病原體診斷，而對于少見的、罕見的病原微生物，更是無法精準性的識別。

高通量測序技術又稱二代測序技術，具有檢測速度快、準確率高、覆蓋面廣等特點，能很好地直接從臨床樣本(血液、腦脊液、肺泡灌洗液等)中識別罕見、新穎、難以檢測和共感染的病原體[5]，近年來研究者應用mNGS技術陸續對人類皰疹病毒、偽狂犬病毒、囊蟲、弓形蟲等感染提供了的診斷依據[6-7]，并指導治療有效。在臨床研究中，mNGS技術提供了腦膿腫患者嗜血桿菌、腦炎患者的豬鏈球菌、水痘帶狀皰疹病毒、人類皰疹病毒6B、人類(伽馬)皰疹病毒第四型等病原體的精準證據。

本研究中mNGS陽性共16例，靈敏度61.74%，特異度為100%。國外有研究也發現NGS有診斷特異度高、靈敏度低的特點，與本研究結果[8]一致。為綜合考慮靈敏度和特異度，我們使用ROC曲線對mNGS診斷能力進行判斷，ROC曲線下面積(AUC)為0.81，說明mNGS在中樞神經系統感染性疾病的診斷能力較強。同腦脊液培養相比，我們使用綜合判別改善指數(IDI)來進行說明，IDI是指新模型(NGS)和舊模型(腦脊液培養)對于每個個體預測中樞神經系統感染發生概率之差，結果發現IDI=0.35>0，說明mNGS預測感染性疾病的概率高于腦脊液培養，mNGS更準確。本次研究定量的反映了mNGS的診斷能力，并與傳統腦脊液培養的診斷手段進行了比較，用數據證明了mNGS為臨床中樞神經系統感染性疾病更好的診斷手段。

但是，并非所有的患者均能得到陽性結果，本研究中分析原因可能為：①采樣環節造成的假陰性，如病原載量過低，采集到的病原低于檢測限，或者未取到感染部位的樣本；②儲存或運輸過程造成的假陰性，如未嚴格-20℃低溫凍存導致核酸降解；③實驗環節造成的假陰性，如真菌破壁效率較低，影響真菌檢出率；④數據庫不完善造成的假陰性，如新發病原體未包含在數據庫中，從而無法檢測出新發病原體；⑤mNGS方法學原理造成的假陰性，如人源序列比例過高，導致病原體測序序列數過低。同時我們還需要避免采樣環節如腰椎穿刺過程、標本轉移過程的污染，實驗環節、測序環節的污染如實驗試劑、耗材、氣溶膠的污染、測序錯誤等。所以，得到mNGS數據后，我們還要綜合患者的臨床特點、腦脊液特性、測序序列數的情況進行綜合分析，從而得到可靠的診斷結果，進行精準治療，改善患者預后。另外隨著技術進步，如果更有效的工作流程，更低的檢測成本、快速周轉時間，以及簡化精確的解釋標準，mNGS將在臨床實踐中被廣泛接受。

綜上所述，相對于陽性率較低的病原微生物培養技術，mNGS技術通過分析樣本的病原微生物的序列信息，判斷出微生物的物種，具有高效、快速、精準的優勢，為我們臨床感染性疾病的診治提供有力的依據，對改善患者的臨床預后具有積極意義。