生姜漱口水抗菌活性的研究

朱婷婷 李宏俊 何雨 崔文麗 馬偉 沈悅(亳州學院，安徽 亳州 236800)

0 引言

生姜(Zingiber officinale Roscoe)又名地辛、百辣云，屬姜科姜屬多年生草本植物，藥食兩用。它既是一種調(diào)味料，也是一味常見的中藥材。經(jīng)典藥學著作研究表明，它具有解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳、解魚蟹毒之功效，被譽為“嘔家圣藥”。生姜油(Ginger oil)為生姜的提取物，在醫(yī)藥行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是在保健及疾病的預防和治療方面，如抗衰老、抑菌、溶栓、降血脂、抗腫瘤等[1]，有明顯的功效。

近年來，口腔疾病愈發(fā)引起醫(yī)學界的關(guān)注，口腔“炎癥”問題為重中之重，而炎癥的有效控制在于提高機體抵抗力和降低微生物數(shù)量[2-4]，最平常的刷牙并不能完全清楚炎癥，且市面上大多數(shù)牙膏都以美白牙齒和改善口氣為主，并不能完全清楚這些炎癥。功能性的漱口水作為一種補充方法，具有良好的滲透性，可深入口腔各部位，包括牙刷難接觸的牙齦邊緣和牙縫間，從而起到有效的抑菌作用，改善口腔健康[3-4]

本研究以生姜油為原料，添加檸檬酸、山梨醇、木糖醇等開發(fā)成一種新型漱口水，并具有很好的清潔口腔和抑菌作用，為其未來產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器

XSE104電子天平(梅特勒-托利多 METTLER TOLEDO)、超純水器(科寧特 Cleaned)、SW-CJ-1F/1FD單人單面垂直送風凈化工作臺(蘇州凈化)、PWT-P75B恒溫培養(yǎng)箱(達斯卡特)、GR85DA滅菌容器(致微儀器有限公司)、DW-86L338J(2018)超低溫保存箱(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)。

1.2 藥品與試劑

氯化十六烷基吡啶鎓(薩恩化學技術(shù)有限公司)、吐溫-20(天津市科密歐化學試劑有限公司)、檸檬酸(AR，上海展云化工有限公司)、山梨醇(食品級，浙江一諾生物科技有限公司)、木糖醇(食品級，河南萬邦實業(yè)有限公司)、糖精鈉(食品級，河南萬邦實業(yè)有限公司)桂花香精(食品級，河南萬邦實業(yè)有限公司)、慶大霉素(醫(yī)用)、生理鹽水(醫(yī)用)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，北京三藥科技開發(fā)公司)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，北京三藥科技開發(fā)公司)。

1.3 標準菌株

金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ATCC25923)、大腸桿菌 (Escherichia coli ATCC25922)。

2 方法

2.1 生姜漱口水的配制

精密稱取生姜油0.25g，加吐溫2.5g，充分晃動混勻，緩慢加入500mL 60℃的純凈水，充分攪拌至澄清透明。再加入吡啶鎓2.5g，檸檬酸2.5g，山梨醇10g，木糖醇10g，糖精香精若干，充分攪拌混勻，放置3h。待溶液冷卻至室溫，取最上層250mL，灌裝、滅菌、貼標簽，即得生姜漱口水。

2.2 生姜漱口水抗菌活性測試

2.2.1 菌種的活化及培養(yǎng)

將高壓滅菌后的液體培養(yǎng)基(10mL)注入離心管中冷卻至室溫；從-80℃的保存箱里拿出菌種放置至室溫；再在超凈工作臺上用接種環(huán)蘸取菌液放入離心管中(重復2～3次)，每種菌株做三組平行實驗，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h。

2.2.2 菌種的純化培養(yǎng)

用接種環(huán)蘸取2.2.1所述，培養(yǎng)24h后略微渾濁的菌液以平板劃線法在培養(yǎng)基上接種，每個菌種接種三組，結(jié)束后倒置放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。用接種環(huán)挑取平板上獨立的單個菌落，放入裝有液體培養(yǎng)基的離心管中，每種菌株做三組平行實驗，在37℃下培養(yǎng)24h。

2.2.3 細菌總菌落數(shù)的測定

分別取上述2.2.2純化后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液1mL制成不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個稀釋液中分別取出1mL置于無菌平皿中與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，每個濃度做三組平行實驗，結(jié)束后倒置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。挑選每平皿平均細菌菌落數(shù)大于30，小于300的平板計算原始菌液的濃度(CFU·mL-1)

2.2.4 菌懸液的制備

取上述已知濃度的原菌液，加生理鹽水，配置成含菌數(shù)約為0.5麥氏濃度(1×108CFU·mL-1)的菌懸液，4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5 抗菌活性測試

紙片擴散法[5-6]用已滅菌的移液槍吸取100μL菌懸液于TSA培養(yǎng)基表面，用無菌三角涂布棒涂布均勻；分別取生姜漱口水、慶大霉素、生理鹽水各8μL滴于6mm無菌濾紙片上，充分吸收；將含漱口水的濾紙片貼到平板中，并放入含有慶大霉素的濾紙片作為陽性對照和含有無菌生理鹽水的濾紙片作為陰性對照，每種菌株做三組平行實驗。于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，采用十字交叉法量取抑菌圈直徑(mm)，實驗結(jié)果以x±s表示。

2.2.6 最小抑菌濃度(MIC)的測定

采用微量肉湯稀釋法[7-9]測定。取一次性無菌96孔板，在第一排每個孔中分別加入100μL TSB培養(yǎng)基。取100μL漱口水加入到第一孔，混勻后吸取100μL加入第二孔，反復二倍稀釋至第10孔，第10孔吸取100μL棄去。再吸取1×108CFU·mL-1加入到1至11孔，充分混勻后加蓋置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出，用酶標儀測其吸光度。每種菌株做三組平行實驗。

上述1～10孔為實驗組；第11孔只加培養(yǎng)基和菌液作為陽性對照組，用以觀察該濃度的菌液是否生長良好并用于實驗；第12孔只加培養(yǎng)基作為陰性對照組，用以觀察培養(yǎng)基是否被污染。用酶標儀測量實驗組和對照組的吸光度，并計算其MIC。

2.2.7 最低殺菌濃度(MBC)的測定

采用瓊脂培養(yǎng)基平板法[10]進行測定。用移液槍從上述2.2.6的96孔板中未見細菌生長的孔里吸取100μL培養(yǎng)液，接種至TSA培養(yǎng)基中，用無菌三角涂布棒涂布均勻，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。每種菌株做三組平行實驗。

3 結(jié)果與討論

3.1 細菌總菌落數(shù)

計算公式：

式中：C為某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V為涂布平板時所用的稀釋液體積(mL)；M為稀釋倍數(shù)。實驗數(shù)據(jù)詳見表1。

金黃色葡萄球菌濃度：1.02×1011CFU·mL-1；

大腸桿菌濃度：7.7×1010CFU·mL-1。

表1 細菌菌落數(shù)

3.2 抑菌圈

本實驗以抑菌圈大小評價抑菌效果，抑菌圈越大，表示抑菌效果越好，詳見圖1。生姜漱口水對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有不錯的抑菌效果，且抑菌效果穩(wěn)定，二者抑菌圈直徑均>10mm，見表2。

3.3 漱口水MIC和MBC的測定

金黃色葡萄球菌96孔板的吸光度數(shù)據(jù)詳見圖2，大腸桿菌96孔板吸光度數(shù)據(jù)詳見圖3。MIC為生姜漱口水對兩個菌種的平均抑制濃度，MBC為兩菌種每平皿細菌菌落數(shù)小于5對應(yīng)的 漱口水濃度的平均數(shù)，詳見表3。

圖1 不同菌株抑菌圈大小結(jié)果

表2 生姜漱口水的抑菌活性(x±s,n=3)

圖2 金黃色葡萄球菌96孔板吸光度數(shù)據(jù)

圖3 大腸桿菌96孔板吸光度數(shù)據(jù)

表3 生姜漱口水的MIC和MBC測定結(jié)果(n=2)

4 結(jié)語

通過一系列抗菌測試，發(fā)現(xiàn)生姜漱口水對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用都十分顯著，二者MIC都為0.49mg/mL；MBC分別為1.95mg/mL和0.98mg/mL。該漱口水對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用比抗生素更加溫和且安全，不僅能清潔口腔和改善異味，還可以抑制細菌滋生，是一款安全高效的功能性漱口水。本研究豐富了現(xiàn)有口腔護理產(chǎn)品的功能和種類，同時還為生姜漱口水后續(xù)研發(fā)和生產(chǎn)提供了理論參考。