黃芩炭止血作用與吸附力的相關性研究

趙玉升 趙金莉 劉楚妤

摘要：目的 探索黃芩炭（Charred Radix Scutellariae，CRS）體內止血作用與體外吸附力之間的相關性。方法 利用小鼠斷尾出血模型和肝臟出血模型，以出血時間為指標，評價市售黃芩炭（CRS-SH）和馬弗爐燒制品（250℃，300℃，350℃）對止血效果的影響;以紫外-可見分光光度法測定各組黃芩炭對亞甲基藍的吸附力。結果 在小鼠斷尾出血實驗和肝臟出血實驗中，與生黃芩（SB）組比較，黃芩炭均能顯著減少出血時間（P<0.01），且隨著馬弗爐燒制溫度的增高，出血時間減少，出血時間長短順序為：SB>CRS-SH>CRS-250>CRS-300>CRS-350;吸附力實驗結果顯示，吸附力大小順序為：CRS-350>CRS-300>CRS-250>CRS-SH>SB。在一定范圍內，黃芩炭的止血作用隨著吸附力的增大而增大，兩者呈正相關，相關系數大于0.97。結論 黃芩炭止血作用與吸附力的相關性良好，吸附力的大小可以反映止血作用的強弱，該研究為黃芩炭質量控制的體外評價方法提供了實驗依據。

關鍵詞：黃芩炭;止血作用;吸附力

【Abstract】Objective：To study the correlation between the hemostatic effect of Charred Radix Scutellariae（CRS）in vivo and the adsorption capacity in vitro. Methods：The mouse tail bleeding model and liver bleeding model were used to evaluate the hemostatic effect of commercially available CRS-SH and muffle furnace burned products（250℃，300℃ and 350℃）with bleeding time as the index. The UV-Vis spectrophotometric method was used to determine the adsorption of methylene blue by CRS in each group. Results：In the mouse tail bleeding experiment and the liver bleeding experiment，when compared with the raw scutellaria baicalensis（SB）group，the CRS could significantly reduce the bleeding time（P<0.01），and with the increase of the muffle furnace firing temperature，the bleeding time reduced. The order of bleeding time was as SB>CRS-SH>CRS-250>CRS-300>CRS-350. The results of the adsorption force experiment showed that the order of adsorption force was as CRS-350>CRS-300>CRS- 250>CRS-SH>SB. Within a certain range，the hemostatic effect of CRS increased with the increase of the adsorption force，and the two were positively correlated，and the correlation coefficient was greater than 0.97. Conclusion：The hemostatic effect of the CRS has a good correlation with the adsorption force. The size of the adsorption force can reflect the strength of the hemostatic effect. This study provides an experimental basis for the in vitro evaluation method of the quality control of the CRS.

【Key words】Charred Radix Scutellariae，hemostatic effect，adsorption force

黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi.簡稱SB）的干燥根，始載于《神農本草經》，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎的功效[1]。黃芩制炭后，其止血作用增強[2-3]，黃芩炭（Charred Radix Scutellariae.簡稱CRS）主要用于血熱導致的吐血、衄血、血崩等各種出血癥[3]。而有關黃芩炭的炮制方法的研究很少，現今中醫藥理論對于黃芩炭“燒炭存性”的標準一直停留在傳統經驗的判斷上。據文獻報道[4]，黃芩炒炭后吸附力明顯增加，推測是其產生止血的主要原因，但是到目前為止，對于止血作用與吸附力的相關性研究報道較少。本文將研究黃芩、市售黃芩炭和馬弗爐悶煅法不同溫度炮制的黃芩炭，其吸附力大小與止血效果之間的相關性，以期為黃芩炭質量控制的體外評價方法提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 紫外分光光度計（CECI，英國，CECI公司）;馬弗爐（TL0612，北京中科（中國澳博科技股份有限公司）;高速萬能粉碎機（PFT-100A，溫嶺市林大機械有限公司），水浴鍋（HH-1，金壇市畫成開元實驗儀器廠），電子分析天平（SA1245-CW，北京賽多利斯科學儀器有限公司，），渦旋混合器（QL-901，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（DGG-9240B，上海森信實驗儀器有限公司），亞甲基藍為分析純（北京索萊寶科技有限公司，批號220D029）

1.2 材料 黃芩、市售黃芩炭購于北京仟草中藥飲片有限公司;生理鹽水購于石家莊四藥有限公司;白眉蛇毒血凝酶購于錦州奧鴻藥業有限公司，水合氯醛購于國藥集團化學試劑有限公司;乙醇和其它分析級化學試劑均購于北京化學試劑公司。所有實驗用水均為去離子水。

1.3 動物 SPF級昆明小鼠，雄性，體重（30±2）g，購于北京斯貝福生物技術有限公司。實驗期間動物均飼養于同一環境下，保持室溫（25±1）℃左右，空氣濕度55%～65%，環境安靜，動物隨意進食進水，明、暗12 h循環飼養。所有動物在實驗前24 h禁食不禁水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 燒制黃芩炭溶液制備 每次稱取黃芩生藥100 g，放于坩堝中，鋁箔紙密封并加蓋于馬弗爐中燒制。馬弗爐程序升溫：第一階段5 min升溫至70 ℃，保溫20 min;第二階段 25 min升溫至250℃（300℃，350℃），保溫1 h。獲得的黃芩炭分別命名為CRS-250，CRS-300，CRS-350，將稱量好的黃芩放置在中藥粉碎機中粉碎。稱取粉末50 g，放置在十倍去離子水中用水浴鍋加熱，溫度設定為100℃，時間為1 h。用濾紙粗過濾殘渣，再使用0.22 μm的微孔濾膜過濾殘渣，合并3次濾液，濃縮濾液，將濃縮后的濾液于4℃保存，留置待用。

2.1.2 黃芩生藥與市售黃芩炭溶液制備 每次稱取黃芩生藥與市售黃芩炭（CRS-SH）100 g，將稱量好的黃芩與市售黃芩炭放置在中藥粉碎機中粉碎。稱取粉末50 g，放置在十倍去離子水中用水浴鍋加熱，溫度設定為100℃，時間為1 h。用濾紙粗過濾殘渣，再使用0.22 μm的微孔濾膜過濾殘渣，合并3次濾液，濃縮濾液，將濃縮后的濾液于4℃保存，留置待用。

2.2 止血作用的研究

2.2.1 試藥配制 樣品的制備：將2.1中獲得的濃縮液放置于蒸發皿上烘干，精密稱取粉末，加入去離子水制備成質量濃度為1 mg/mL的溶液，備用。

陽性藥的配制：取白眉蛇毒凝血酶粉末0.5 KU，加入5 mL質量濃度為9 g/mL的氯化鈉溶液，搖勻，使其完全溶解，制得濃度為0.1 KU/mL的陽性藥溶液，避光保存，備用。

麻醉劑：精密稱量4.0 g水合氯醛粉末，倒入磨口具塞三角瓶中，加入100 mL去離子水，震蕩使完全溶解，備用。

2.2.2 小鼠斷尾出血實驗 取健康昆明小鼠35只，稱重并標號，隨機分成七組，每組5只，分別為生理鹽水組（NS），白眉蛇毒血凝酶陽性藥組（HC，白眉蛇毒血凝酶0.1 KU/mL，0.67 KU/Kg），生黃芩組（SB），黃芩炭炒制組（CRS-SH），黃芩炭不同制備溫度組（CRS-250組，CRS-300組，CRS-350組），給藥劑量為0.5 mL/30 g。動物適應性飼養一段時間后開始給藥，陽性藥組皮下注射給藥，其余各組均腹腔注射給藥。給藥后小鼠自由活動1 h，然后用4%水合氯醛對小鼠進行麻醉。用潔凈的手術剪在距離小鼠尾尖1 cm處將小鼠尾尖剪斷，誘導出血，每隔30 s，使尾尖出血處接觸濾紙片，觀察出血情況，以出血開始到出血停止的時間記為出血時間，記錄實驗結果。

2.2.3 小鼠肝臟出血實驗 分組和給藥同上述斷尾出血實驗。將小鼠麻醉后，用手術剪將小鼠沿腹中線剪開，暴露肝臟。用生理鹽水浸潤的紗布將小鼠的肝臟墊起。用2 mL注射器針頭在小鼠肝臟刺深度為2 mm的創口，按下秒表開始計時，每隔30 s用生理鹽水浸潤的小濾紙片蘸一次傷口，直至濾紙片上沒有血跡，從扎破肝臟開始出血到停止出血的時間記為出血時間，記錄實驗結果。

2.3 統計方法 采用SPSS25.0統計軟件，所有試驗數據以（x±s）表示，統計學處理采用方差分析。單因素ANOVA分析方法用于實驗數據服從正態分布，同時方差齊。組間差異則運用LSD方法統計。P<0.05表示實驗數據之間差異有統計學意義，P<0.01 表示差異有顯著統計學意義。

2.4 實驗結果

2.4.1 黃芩炭的外觀性狀 馬弗爐燒制的3個不同溫度的黃芩炭、生黃芩、市售黃芩炭的外觀性狀，結果見圖1。由圖1可知，市售黃芩炭與馬弗爐不同溫度燒制的黃芩炭顏色質地差別明顯。隨著溫度的升高，黃芩炭的炭化程度加深，顏色越來越深，而炭化產率逐漸降低（CRS-250的產率69.5%，CRS-300的產率56.3%，CRS-350的產率44.93%）。

2.4.2 出血實驗結果 在小鼠斷尾出血和肝臟出血實驗中，與生理鹽水組比較，陽性藥組和生黃芩組、各組黃芩炭均能顯著減少出血時間（P<0.01），結果見表1。在小鼠斷尾出血實驗中，HC組與CRS-350組沒有顯著性差異，CRS-SH組與CRS-250組、CRS-300組沒有顯著性差異。在小鼠肝臟出血實驗中，HC組與各黃芩炭組均沒有顯著性差異，CRS-350組與HC組、CRS-300組沒有顯著性差異。這表明，CRS-300組與CRS-350組在小鼠肝臟出血實驗中具有較好的止血作用，CRS-350組在小鼠斷尾出血實驗中有較好的止血作用，綜合兩個實驗，CRS-350組的止血效果更明顯。實驗表明小鼠斷尾出血和肝臟出血模型的出血時間大小排列順序一致，為：SB>CRS-SH>CRS-250>CRS-300>CRS-350。

2.5 吸附力的測定

2.5.1 亞甲基藍中水分的測定 取亞甲基藍約0.2 g，置于已在105℃干燥至恒重的扁形錐形瓶中，精密稱定，于105℃干燥 5 h 后，測定其水分。結果表明亞甲基藍的含水量為 10.62%。

2.5.2 亞甲基藍標準溶液的配制 取亞甲基藍約0.17 g，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加入pH≈7的磷酸鹽緩沖溶液溶解并稀釋至刻度，按公式計算，得含亞甲基藍干燥品濃度為1.5306mg/mL的亞甲基藍對照品母液，再從中精密量取1.4 mL至100 mL量瓶中，加pH≈7的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度，制成每1 mL含0.02143 mg的亞甲基藍標準溶液，即得。

其中：C1——以干燥品計算的亞甲基藍溶液的濃度

m——未干燥的亞甲基藍的質量

E——亞甲基藍的水分

V——溶液體積

2.5.3 供試品溶液的制備 取2.2.1中制備的SB、CRS-SH，CRS-250，CRS-300，CRS-350粉末，各約0.1 g，精密稱定，置100 mL磨口具塞錐形瓶中，精密加入濃度為0.02143mg/mL的亞甲基藍溶液20 mL，置恒溫振蕩器上，室內環境溫度控制在25℃左右，振蕩器轉速為150r/min，震蕩40min，濾過，即得。

2.5.4 方法學考察

2.5.4.1 線性關系考察 精密移取亞甲基藍標準溶液0 mL，0.5 mL，1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，分別置25 mL容量瓶中，加pH≈7的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻。以第一份溶液為空白，在665nm處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，亞甲藍的量為橫坐標，繪制標準曲線。計算回歸方程為：Y=9.1634X+0.0176，r=0.999，表明亞甲基藍在0.010715 mg～0.10715 mg之間呈良好的線性關系（表2）。

2.5.4.2 精密度試驗 精密量取亞甲基藍標準溶液3 mL置25 mL容量瓶中，加pH≈7的磷酸鹽緩沖溶液至刻度，取該溶液連續測定6次，RSD為0.21% 表明本方法精密度良好（表3）。

2.5.4.3 重復性試驗 取2.2.1中制備的CRS-SH粉末 0.1 g，按2.5.3 項下方法制備供試品溶液6份，以PBS緩沖溶液為空白對照，在665 nm處測定吸光度，帶入標準曲線計算供試品溶液中游離的亞甲基藍量，并根據吸附力=吸附量/樣品量，計算出吸附力。重復性結果表明CRS的平均吸附力為1.253，RSD為0.29%，結果表明本方法重復性良好（表4）。

2.5.4.4 加樣回收率試驗 取2.2.1中制備的CRS-SH粉末0.1 g，共6份，精密稱定，置100 mL磨口具塞錐形瓶中，每份均精密加入濃度為0.02143 mg/mL的亞甲基藍溶液20 mL，置于振蕩器上，保持室溫在20℃左右，振蕩器轉速150 r/min，震蕩40 min，濾過，測定吸光度，計算得平均回收率為103.68%，RSD為1.03%。結果見表5。

公式：理論未吸附量=已知準確加入的亞甲基藍的量-樣品中吸附亞甲基藍的量。

回收率（%）=檢出量理論未吸附量×100%

2.5.5 樣品吸附力的測定 取2.2.1中制備的SB，CRS-SH，CRS-250，CRS-300，CRS-350的粉末，依法處理，以PBS緩沖液為空白，測定吸光度，計算出亞甲基藍未被吸附的量，進一步計算出吸附力。結果見表6。

由表6可以得出黃芩炭比生黃芩的吸附性增加，由馬弗爐燒制的黃芩炭的吸附力更大，其排列順序為：CRS-350>CRS-300>CRS-250>CRS-SH>SB。

2.6 止血作用與吸附力的相關性 本研究中小鼠斷尾和肝臟出血時間反應的是止血作用強弱，出血時間越短，止血作用越強。從圖2可以看出，在一定范圍內，黃芩炭的出血時間與吸附力呈負相關，即止血作用與吸附力呈正相關，且相關系數大于0.97，相關性良好。

3 討論

馬弗爐悶煅法炮制溫度的選擇：本研究在馬弗爐悶煅法制備黃芩炭的過程中，曾設置了較低溫度200℃和較高溫度400℃兩個溫度點，但是200℃下制備的黃芩炭炭化程度比較低，表面呈焦黃色，與炒炭的要求相差較大，屬于炮制程度“不及”;而400℃下制備的黃芩炭已經出現了明顯灰化，屬于炮制“太過”，故在兩個溫度下制備的黃芩炭均沒有進行止血藥效實驗。

止血實驗：由于止血涉及多途徑的相互作用，體外止血實驗具有一定的片面性，故本研究選擇小鼠進行體內止血實驗，更能反映止血的整體效應。在止血模型的選擇上，選取了斷尾出血和肝臟針刺出血兩個典型的出血模型[5-8]來評價黃芩炭的止血作用，結果陽性藥物組與生理鹽水組在出血時間上有顯著差異，不同炮制方法制備的黃芩炭均表現出一定的止血作用。

以吸附力作為炭藥質量控制的指標，對炭藥質量標準和炮制工藝的研究重要意義。據報道，藕節炒炭后，吸附力增強，對小鼠的凝血作用增強[9];干姜炒炭后吸附力比生品增強，其止血作用也相應增強[10]。而黃芩炒炭后的吸附力變化與止血藥效之間的直接關系，目前還未見報道。本研究明確了黃芩炭止血作用與吸附力之間呈正相關，并在一定程度上篩選出了馬弗爐悶煅法制備黃芩炭的較優工藝條件。為將來以吸附力為評價指標優選黃芩炭的炮制工藝、提取工藝和質量控制等研究奠定了堅實的基礎。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業出報社，2015：211.

[2]周海明.中藥炒炭止血機理的概述[J].海峽藥學，2012，24（11）：56-57.

[3]王劍，徐丹洋，陳佩東，等.黃芩炭對血熱出血大鼠止血有效部位研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（11）：153-156.

[4]黃琪，孟江，吳德玲，等.黃芩炒炭前后鞣質含量及炭素吸附力的比較[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（22）：82-84.

[5]XinYan，YanZhao，JuanLuo，et.al.Hemostatic bioactivity of novel Pollen Typhae Carbonisata-derived carbon quantum dots[J].Journal of Nanobiotechnology，2017，15（1）：60.

[6]Meiling Zhang，Yan Zhao，Jinjun Cheng，et.al.Novel carbon dots derived from Schizonepetae Herba Carbonisata and investigation of their haemostatic efficacy[J].Artificial Cells，Nanomedicine，and Biotechnology，2017：1.

[7]Xiaoman Liu，Yongzhi Wang，Xin Yan，et.al.Novel Phellodendri Cortex（Huang Bo）-derived carbon dots and their hemostatic effect.Nanomedicine（Lond）[J]，2018，13（4）：391-405.

[8]Wang YZ，Kong H，Liu XM，et al.Novel Carbon Dots Derived from Cirsii Japonici Herba Carbonisata and Their Haemostatic Effect.Journal of Biomedical Nanotechnology，2018，14（9）：1635.

[9]連曉曉，胡昌江，余凌英，等.藕節“炒炭存性”標準的研究[J].中成藥，2010，32（9）：1545-1548.

[10]孟江，許舒婭，陳磊，等.干姜“炒炭存性”質量標準初探[J].中國中藥雜志，2012，37（4）：453-456.