抗霾清肺飲的制備工藝及其功效研究

周文靜1,劉必旺1,張 萌1,王珊珊1,秦 楠

(1.山西中醫藥大學基礎醫學院,山西晉中 030619;2.山西中醫藥大學制藥與食品工程學院,山西晉中 030619)

“霧霾”是指空氣中存在的有毒有害顆粒物與水汽的混合物,是霾與霧的結混合物,稱為霧霾。近年來,中國不少地區都出現了“霧霾天氣”,甚至作為一種災害性天氣出現,因霧霾可引起呼吸、心血管、生殖系統等多方面疾病[1],人們“談霾色變”。霧霾的元兇PM2.5具有直徑小、毒性強的特點,可隨呼吸進入支氣管、細支氣管,最后沉降于肺泡[2],由于缺乏清除措施,可形成慢性肺組織損傷[3]。對霧霾引發的健康問題不僅需要藥物治療,更需要提前預防,研究一種有效的抗霾清肺功能食品具有重要意義。

中醫強調“正氣存內,邪不可干”[4],黃芪為常用補氣藥,始載于《神農本草經》,列為上品,味甘,微溫,歸肺、脾經,具有益氣固表、托毒斂瘡、利水消腫等作用[5]。現代藥理研究表明,黃芪具有增強免疫的功能[6],可以治療多種肺系疾病,如肺炎、肺纖維化、肺癌等[7-9]。同時黃芪作為2018年國家衛計委新增的藥食同源藥材,具有良好的開發前景。羅漢果(Siraitiagrosvenorii)為葫蘆科多年生藤本植物的果實[10],是清咽利肺、止咳化痰的首選,其甜度較高,且不產生熱量,安全無毒,是飲料、糖果行業上好的原料[11]。梨,百果之宗,具有生津止喝,止咳化痰,清肺去燥的功效,中醫認為燥邪易傷肺,秋燥多食梨。

目前,抗霧霾的功能健康食品包括飲料、保健酒、茶等,其中保健飲料類最受國內研究者關注[12],但以黃芪為原料的抗霾清肺飲品,未見報道。本研究以黃芪、羅漢果、梨為原料,其中黃芪甲苷是黃芪中最主要的有效成分,一般含有黃芪的處方或者中成藥都將其作為含量控制指標。黃芪甲苷屬于黃芪多糖的一種,其具有較強的生物活性。研究報道,黃芪甲苷能有效改善PM2.5誘導大鼠的生存狀態,減輕肺水腫和肺組織Mc Guigan病理評分,從而實現預防PM2.5所致急性肺損傷的目的[13]。本研究通過高效液相色譜(HPLC)法檢測抗霾清肺飲中黃芪甲苷含量,采用單因素實驗結合正交試驗法優化抗霾清肺飲的制備工藝,并進一步通過動物實驗考察其抗霾清肺作用,以期為抗霾清肺飲料開發研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃芪(膜莢黃芪)、羅漢果(拉江果) 山西維康堂中藥飲片有限公司;黃原膠 河北萬邦實業有限公司;白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒 南京建成生物有限公司;皇冠梨、香煙(紅塔山)、蒸餾水 市售;甲醇 天津四友精細化學品有限公司;黃芪甲苷對照品(批號:105753-20 1809) 上海禾午生物科技有限公司;小鼠(SPF級,BALB/C,生產和使用許可證號:SCXK(京)2016-0011) 北京維通利華實驗動物技術有限公司。

Waters2695型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;BS224S1/萬電子天平 德國賽多利斯集團;霾表M1 漢王科技股份有限公司;DL-5-B低速離心機 上海安亭科學儀器廠;ZX-S24型全不銹鋼恒溫水浴鍋 上海知信實驗儀器技術有限公司;II-B(500 mL)型磁力攪拌電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司;RSCG01-1型超高溫瞬時滅菌機 鄭州玉翔機械設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗霾清肺飲的制備工藝 工藝流程:黃芪、羅漢果、梨→浸泡→煎煮過濾→復煎→離心→調配→均質→罐裝滅菌→冷卻→成品

工藝要點:a煎煮與離心:選取一定量黃芪、羅漢果的干燥飲片,將羅漢果敲碎成小塊,加水浸泡30 min。然后加入切成1 cm小方塊的梨,文火煎煮30 min,用兩層紗布過濾得藥液,靜置。往濾渣中加入水,再次煮沸,文火煎煮20 min,用兩層紗布過濾,合并煎煮液,濃縮。以3500 r/min的速度離心30 min,棄沉淀,然后進行抽濾,得濾液[14]。b調配與均質:濾液中直接添加一定量的黃原膠在75 ℃下水浴加熱30 min,并用玻璃棒充分攪拌,使黃原膠充分溶解。將配制的飲料于均質機中,在20 MPa壓力下均質處理,使溶液中成分物質均勻分布。c殺菌與灌裝:在高溫下瞬時滅菌,滅菌溫度為120 ℃,時間為5 s。最后無菌的環境下灌裝,封口,灌裝的溫度控制在恒溫75 ℃左右,灌裝之后冷卻到室溫[15-16]。

1.2.2 HPLC法測定黃芪甲苷含量

1.2.2.1 色譜條件 PersilBDSC18(200 mm×4.6 mm,5 μm)為色譜柱;流動相:乙腈-水(35∶65);流速:1.0 mL/min;檢測波長260 nm;柱溫35 ℃,進樣量為10 μL,理論板數以黃芪甲苷峰計算應不低于8000。

1.2.2.2 溶液制備 對照品溶液的制備:精密稱取黃芪甲苷5 mg,加入甲醇,配制成濃度為200 μg/mL的對照品溶液。

供試品溶液的制備:取抗霾清肺飲100 mL置分液漏斗中,加正丁醇溶液提取3次,每次100 mL,用氨試液洗滌3次,每次100 mL,棄去氨試液,取正丁醇層放入水浴鍋中蒸干,最后殘渣加甲醇溶解并定容到10 mL量瓶中,用微孔濾膜過濾,即得供試品溶液。

陰性對照液溶液的制備:根據抗霾清肺飲制備工藝,剔除黃芪,按供試品的制備方法制成陰性對照品溶液。

1.2.2.3 專屬性考察 取黃芪甲苷對照品溶液、供試品溶液和缺黃芪的陰性對照品溶液,分別按“1.2.2.1”中色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。

1.2.2.4 標準曲線繪制 將冷藏保存的對照品溶液精密量取,體積為5 mL,加甲醇進行等梯度稀釋,稀釋后黃芪甲苷的濃度分別為:10、50、100、150、200 μg/mL。上機測量5種濃度的對照品溶液,繪制標準曲線。

1.2.2.5 樣品測定 分別選取不同試驗組別的抗霾清肺飲樣品,按照“1.2.2.1”中色譜條件進樣測定,以計算飲料中黃芪甲苷的含量。

1.2.3 單因素實驗 按照各因素加入水的質量體積比進行試驗。固定反應條件為羅漢果3%、梨30%、黃原膠0.15%,考察黃芪添加量(1%、5%、10%、20%、30%)對黃芪甲苷含量和感官評價的影響;固定反應條件為黃芪10%、梨30%、黃原膠0.15%,考察羅漢果添加量(1%、2%、3%、4%、5%)對黃芪甲苷含量和感官評價的影響;固定反應條件為黃芪10%、羅漢果3%、黃原膠0.15%,考察梨添加量(20%、30%、40%、50%、60%)對黃芪甲苷含量和感官評價的影響;固定反應條件為黃芪10%、羅漢果3%、梨30%,考察黃原膠添加量(0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%)對黃芪甲苷含量和感官評價的影響,從而確定各因素的最佳添加量。

表1 感官評分測試評價Table 1 Sensory score test evaluation

1.2.4 感官評定標準 本測試由20名有評定經驗的專家組成評審組,以外觀、香氣、色澤、口感、組織狀態五個方面為指標進行評定。取三次重復實驗的平均值作為試驗最終記錄值。具體評分標準見表1。

1.2.5 正交試驗 根據單因素實驗結果確定黃芪、羅漢果、梨、黃原膠的因素水平。根據飲料中黃芪甲苷含量和對飲料感官品質的影響,采用 L9(34)正交表進行正交試驗。正交試驗因素水平表見表2。

表2 抗霾清肺飲正交實驗因素和水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experimentfor anti-haze Qingfei drink

1.2.6 抗霾清肺飲功效測定

1.2.6.1 造模及給藥 SPF級昆明小鼠40只,雌雄各半,體重18～20 g,隨機分為空白組,模型組,抗霾清肺飲預防組,抗霾清肺飲治療組,每組10只。適應飼養一周,預防組提前給藥1周,灌胃按照1.5 mL/10 g抗霾清肺飲,每天2次,連續7 d。除空白組外,其余各組采用連續香煙煙霧暴露法建立霧霾小鼠模型,將小鼠置于塑料鼠籠中,蓋好蓋子,將3支香煙置于蓋子上,將另一鼠籠倒扣于蓋子上,制成半密閉空間,讓煙自然燃燒,15 min后打開熏煙頂蓋,待煙霧全部散去,小鼠休息5 min,然后再次點燃3支香煙重復上述步驟,每天熏煙2次,每次2 h,并用霾表實時監測,保證PM2.5濃度超標,通過檢測小鼠病理切片,保證造模成功[17-18]。從第8 d開始治療組灌胃抗霾清肺飲,每日2次,連續7 d,其余各組灌予相應劑量生理鹽水。

1.2.6.2 肺組織病理檢測 于末次給藥后禁食12 h,將老鼠處死,取同一部位肺組織,放入10%甲醛溶液中固定,制備切片,HE染色,光鏡觀察。

1.2.6.3 TNF-α、IL-6含量測定 用0.25 mol/L蔗糖溶液制備肺組織勻漿,離心取上清液[19],按ELISA試劑盒說明書操作步驟進行測定TNF-α、IL-6含量。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 HPLC法測定黃芪甲苷含量

2.1.1 專屬性考察結果 圖1結果顯示抗霾清肺飲供試品溶液色譜圖呈現與黃芪甲苷對照品溶液相同保留時間的色譜峰,且基線平穩、分離度好,而陰性對照品溶液在此保留時間無色譜峰。

圖1 黃芪甲苷高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of astragaloside IV

2.1.2 線性關系考察結果 以黃芪甲苷濃度為橫坐標(Y),峰面積值為縱坐標(X),繪制標準曲線,可得回歸方程為:Y=31.912X+462.46(r=0.9998)。結果顯示黃芪甲苷在10～200 μg/mL的濃度范圍內,線性關系良好。

2.2 單因素實驗結果

以黃芪甲苷含量和感官評分為考察指標,確定各因素的最佳添加量。圖2A顯示,在其它因素固定的情況下,黃芪添加10%與20%時,黃芪甲苷含量最高為0.83 mg/mL。結合感官評分,當黃芪添加10%時,感官評分最高?？赡苡捎谒幉谋旧砭哂袧饬业亩剐任?隨著添加量增加,掩蓋了其他原料的味道,藥味太濃。而用量較少時,飲料香味偏淡,味道不突出。確定以黃芪添加量10%進行進一步實驗。

圖2B顯示,當羅漢果添加量為1%與2%時黃芪甲苷含量最高,但隨著羅漢果添加量增加,黃芪甲苷含量降低,可能由于配伍作用后影響黃芪甲苷含量。羅漢果添加量2%時感官評分最高,隨著用量加大,羅漢果甜味過濃,感官評分值也降低。綜合評定,確定羅漢果添加量為2%。

圖2 不同因素對飲料黃芪甲苷含量和感官評分的影響Fig.2 Effects of different factors on astragaloside IV contents and sensory score of drink

圖2C顯示,梨的添加量為30%、40%、50%時,黃芪甲苷含量均為0.82 mg/mL,可以發現不同添加量的梨對黃芪甲苷含量影響不明顯。梨味道香甜,添加量50%時,飲料有淡淡果味香氣,感官評分最高,確定梨的添加量為50%。

圖2D顯示,黃原膠添加量為0.1%時,黃芪甲苷含量最高,且口味較協調,感官評分亦最高,當黃原膠添加較多時,飲料不清亮,給人不愉快感。確定黃原膠添加量為0.1%。

2.3 正交試驗結果

抗霾清肺飲的主要成分為黃芪,其中黃芪甲苷是防治PM2.5,發揮抗霾清肺作用的主要有效成分[13],而感官評分是描述和判斷產品質量最直觀的指標,直接影響產品的質量與安全控制,因此設定黃芪甲苷的權重為0.5,感官評分的權重為0.5。根據公式(綜合評分=[(黃芪甲苷含量/黃芪甲苷含量最大值)×0.5+(感官評分/感官評分最大值)×0.5]×100)計算,再以綜合評分結果進行正交試驗結果分析。表3可知,最佳工藝參數為A1B2C2D2。影響因素依次為A>C>D>B,可見黃芪添加量是最主要因素,影響最為突出,梨添加量次之,黃原膠添加量對品質的影響僅次于梨,羅漢果添加量對飲料影響最小。由此可得加入9%黃芪、2%羅漢果、50%梨、0.1%黃原膠口感最佳,為最優配比。

表3 正交實驗結果Table 3 Orthogonal test results

2.4 驗證試驗

為了確保該制備工藝的可行性與合理性,按照優選的試驗方案,進行了3次驗證試驗。結果見表4,三批抗霾清肺飲的黃芪甲苷含量為0.83～0.85 mg/mL,均值為0.84 mg/mL,黃芪甲苷含量與文獻報道含黃芪的口服液中含量相近[20-21]。且感官評分均分為94.67分,接近于正交試驗中最大值,表明抗霾清肺飲制備工藝穩定。

表4 驗證試驗結果(n=3)Table 4 Results of verification test(n=3)

2.5 抗霾清肺飲功能試驗

2.5.1 HE染色結果 空白組肺組織形態正常,結構清楚,未見明顯病變;模型組肺組織表現間質淋巴細胞浸潤,瘀血,間質增厚,吞噬細胞增多,肺泡擴張,細支氣管粘膜可見輕度增生;預防組與治療組較模型組均有所減輕,未見粘膜炎癥反應及分泌物,見圖3。

圖3 各組小鼠肺臟病理組織切片(HE,200×)Fig.3 Lung pathological sections ofmice in each group(HE,200×)

2.5.2 TNF-α、IL-6檢測結果 TNF-α為炎癥反應啟動因子,可調節細胞炎癥因子IL-6的釋放,進而誘導炎癥發生,引起肺組織損傷[22-24]。實驗結果顯示,與空白組相比,模型組TNF-α、IL-6含量極顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,治療組TNF-α、IL-6含量極顯著降低,差異有統計學意義(P<0.01),預防組TNF-α含量極顯著降低,差異有統計學意義(P<0.01),見表5。說明抗霾清肺飲可以降低霧霾小鼠肺臟的炎性反應,通過抗炎而發揮作用。

表5 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6含量比較Table 5 Comparison of contents of TNF-αand IL-6 in lung tissues of mice in each group

3 結論

本研究采用中藥傳統湯劑的煎煮方法,遵循傳統劑型,通過單因素實驗與正交試驗確定黃芪液添加量9%,羅漢果添加量2%,梨添加量50%,黃原膠添加量0.1%;在此配方下該產品呈黃棕色,均勻透亮,梨的果香與藥香味相結合,酸甜適中,口感適宜。功能實驗表明,抗霾清肺飲可能通過降低霧霾模型小鼠的炎性反應而發揮治療定作用,且發現治療效果優于預防效果,該產品可作為抗霧霾的有效功能飲品,具有廣闊的市場前景。