強化發(fā)酵對諾麗果成分的影響及抗氧化活性研究

王 越,趙文謹,謝云飛,姚衛(wèi)蓉,郭亞輝,成玉梁,錢 和

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214000)

在夏威夷和波利尼西亞地區(qū),傳統(tǒng)醫(yī)學從業(yè)者用諾麗果(MorindacitrifoliaL. Noni)治療或預防各種疾病已經有兩千多年的歷史[1]。諾麗果實含有200多種植物化學物質,其中多酚類、蒽醌類和黃酮類等活性物質在諾麗果的生物活性方面起著關鍵作用,但在不同品種中其含量差異顯著[2-3]。如今,諾麗果越來越多的藥用價值和保健功能被證實,例如抗菌、抗腫瘤、抗寄生蟲、鎮(zhèn)痛、降壓、抗炎和增強免疫力等[4-6]。因此,諾麗果也迅速成為世界藥用植物和保健類產品的新寵。成熟的諾麗鮮果具有強烈的刺激性氣味,不適宜直接食用,所以出現多種多樣的諾麗果加工形式,如諾麗凍干粉、諾麗果干、諾麗發(fā)酵果汁等,其中發(fā)酵果汁逐漸成為其主要應用形式[1,7]。

目前,諾麗果的發(fā)酵生產大多沿用波利尼西亞傳承下的古老方式,即將洗凈的諾麗果放在密封的發(fā)酵容器中,利用諾麗果自身所帶微生物在室溫下進行自然發(fā)酵,靜置發(fā)酵三個月到一年甚至更長時間[2,4]。近些年也出現一些其他諾麗果汁發(fā)酵方式,如Wang等[8]利用不同乳酸菌發(fā)酵諾麗果,通過檢測發(fā)酵期間的理化指標、微生物數量及抗氧化性的變化情況,發(fā)現最適宜發(fā)酵諾麗果的乳酸菌是植物乳桿菌和雙歧桿菌。此外,還有利用纖維素酶將諾麗果酶解后再進行發(fā)酵[9]、酵母菌發(fā)酵[10]和加糖發(fā)酵[11]等發(fā)酵方式。由于缺少統(tǒng)一的質量標準和科學的評價體系,現在市場上充斥著各式各樣、五花八門的諾麗發(fā)酵果汁產品,品質良莠不齊[8]。

植物乳桿菌因其保健功能和產細菌素特性是工業(yè)發(fā)酵最常用的乳酸菌[8],本文在諾麗果前期自然發(fā)酵基礎上接種植物乳桿菌發(fā)酵劑,對諾麗果進行強化發(fā)酵研究。通過監(jiān)測和分析諾麗果強化發(fā)酵過程中關鍵理化指標(pH、總酸、可溶性固形物、總糖)、有機酸、活性成分(總酚、總黃酮、蘆丁、槲皮素、東莨菪素)含量以及發(fā)酵產品抗氧化能力的變化規(guī)律,科學、系統(tǒng)地評價諾麗果發(fā)酵產品的品質,為進一步深入開展諾麗果發(fā)酵過程及功能成分研究建立理論基礎,同時也為諾麗果工業(yè)化發(fā)酵生產提供重要的工藝和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

諾麗果 無錫諾園生物科技有限公司;植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,CICC22703)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒 南京建成生物工程研究所;MRS培養(yǎng)基 北京陸橋技術股份有限公司;乙腈、甲醇 均為色譜純,美國Tedia公司;蘆丁(純度≥99%)、東莨菪素(純度≥99%)、三氟乙酸(光譜純)、槲皮素(生化試劑,純度≥99%) 美國Sigma試劑有限公司;氫氧化鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、濃硫酸、福林酚和碳酸鈉等試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

AX224ZH/E電子天平 奧豪斯儀器有限公司;KQ-600KDB型高功率數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;SW-CJ-2D型單面垂直送風凈化工作臺 上海鼎科科學儀器有限公司;T9雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;RJ-TDL-50A低速臺式大容量離心機 無錫市瑞江分析儀器有限公司;DH4000BII電熱恒溫培養(yǎng)箱 杭州賽普科學儀器有限公司;1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;SCION SQ 456-GC氣質聯用儀 美國布魯克公司;Millipore超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 諾麗果發(fā)酵工藝設計 參考陸雨[12]的發(fā)酵方式,有所改動。取新鮮、無破損的諾麗果,洗凈表面,晾干后立即放入密封無菌玻璃罐中。25 ℃放置7 d后,待果實完全成熟,將其裝入無菌袋中拍打、8 h/s勻質1 min,所得諾麗果泥密封在無菌玻璃罐待用。將以上諾麗果泥均勻分為2份(每份1 kg),其中:強化發(fā)酵組(IF):接種植物乳桿菌(通過前期實驗確定最佳接種量2.5%(w/w),活化至兩代);對照組(NF):自然發(fā)酵。兩組樣品均置于25 ℃[13]條件下繼續(xù)發(fā)酵30 d,總發(fā)酵時長37 d。分別于0、7、9、16、23、37 d取樣,并立即置于-80 ℃保存。工藝流程圖如下:

圖1 諾麗果發(fā)酵工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of noni fruit fermentation

1.2.2 發(fā)酵過程中pH、總酸、可溶性蛋白和總糖的測定 pH和總滴定酸度的檢測方法參考國標《GBT 15038-2006 葡萄酒、果酒通用分析方法》。可溶性蛋白的測定采用考馬斯亮藍法[13]。總糖含量的測定采用蒽酮比色法[14]。

1.2.3 植物乳桿菌的測定 采用《GB 4789.35-2016 食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》。

1.2.4 發(fā)酵過程中有機酸含量的測定 用高效液相色譜(HPLC)法測定諾麗果汁中有機酸的含量[15],包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸和富馬酸。將諾麗果汁4000 r/min離心10 min取上清,稀釋5倍后微濾(0.45 μm)過膜,HPLC分析。采用 Ecosil C18色譜柱,流動相為甲醇-水-H3PO4溶液(A體積比80∶15∶5;B體積比5∶90∶5),柱溫30 ℃,流速0.5 mL/min,進樣量為5 μL,UV檢測(210 nm)。流動相梯度洗脫條件如下:

表1 有機酸測定流動相梯度洗脫條件Table 1 Gradients elution conditions of mobilephase for determination of organic acids

1.2.5 發(fā)酵過程中總酚和總黃酮含量的測定

1.2.5.1 發(fā)酵諾麗果汁總酚含量測定 Folin-Ciocalteu比色法[16]。以沒食子酸的濃度(x)為橫坐標,波長760 nm處的吸光度值(y)為縱坐標,繪制沒食子酸標準曲線。沒食子酸標準曲線線性回歸方程為y=0.0047x+0.0597,決定系數R2=0.9993。根據沒食子酸標準曲線線性回歸方程計算樣品中總酚含量。

1.2.5.2 發(fā)酵諾麗果汁總黃銅含量測定 NaNO2-Al(NO3)3比色法[17]。以蘆丁的濃度(x)為橫坐標,波長510 nm處的吸光度值(y)為縱坐標,繪制蘆丁標準曲線。蘆丁標準線性回歸方程為:y=0.0033x+0.0484,決定系數為R2=0.999。根據蘆丁標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮含量。

1.2.6 發(fā)酵過程中三種主要單體植物素成分含量的測定 測定發(fā)酵過程中蘆丁、槲皮素和東莨菪素的含量變化。稱取諾麗果泥2.0 g加入8.0 mL甲醇,以頻率為50 kHz,溫度為25 ℃超聲提取30 min后,得到溶液離心5 min(3000 r/min),取上清液過0.45 μm微孔濾膜后進樣分析[18]。每份樣品平行測定3次。檢測條件參考羅宇展[19]的檢測方法,采用Ecosil C18色譜柱,流動相A:1 mL/L乙腈+1 mL/L磷酸,流動相B:100%乙腈,柱溫40 ℃,流速1 mL/min,進樣量為5 μL,在345 nm進行檢測[20]。流動相梯度洗脫條件如下:

表2 三種主要單體植物素測定流動相梯度洗脫條件Table 2 Gradients elution conditions of mobilephase for determination of three compounds

1.2.7 發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的測定

1.2.7.1 總抗氧化能力(T-AOC)的測定 使用總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒(比色法)進行測定。

1.2.7.2 清除二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)能力的檢測 參考文獻[21]方法。將1 mL諾麗發(fā)酵果汁用磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)稀釋10倍混勻,作為待測液。分為以下3組:

表3 DPPH自由基清除能力測定操作表Table 3 DPPH free radical scavengingcapacity determination operation table

分別充分混勻后室溫避光反應30 min,517 nm波長下測定吸光度值,每個試樣重復3次。DPPH自由清除率計算公式如下:

DPPH自由基清除能力(I,%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中，A0、A1和A2分別為空白、樣品和對照的吸光度值。

1.2.7.3 清除羥自由基能力的檢測 參考文獻[22]方法。將1 mL諾麗發(fā)酵果汁用磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)稀釋5倍混勻,作為待測液。分為以下3組:

表4 羥自由基清除能力的測定操作表Table 4 Hydroxyl free radical scavengingcapacity determination openation table

分別充分混勻后于37 ℃水浴中反應30 min,510 nm波長下測定吸光度值,每個試樣重復3次。羥基自由基清除率計算公式如下:

OH自由基清除能力(I,%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中,A0、A1和A2分別為空白、樣品和對照的吸光度值。

1.3 數據分析

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵過程中pH、總酸、可溶性蛋白和總糖的變化

圖2 諾麗果發(fā)酵過程中pH、總酸、可溶性蛋白和總糖的變化Fig.2 Changes in the pH,total acidity,soluble protein content and total carbohydrate content during noni fermentation注:圖中字母不同表示差異顯著(P<0.05),小寫字母代表NF組,大寫字母代表IF組,圖3～圖5、圖7同。

2.2 發(fā)酵過程中有植物乳桿菌數量的變化

由圖3可知,諾麗果發(fā)酵過程中植物乳桿菌數量大體呈現先增加后降低的趨勢,與Chan-Blanco等[24]得出的結論一致。其中,IF組在9 d植物乳桿菌數量迅速增加至7.80×106CFU/mL,這是由于初始發(fā)酵階段營養(yǎng)物質充足,環(huán)境適宜,植物乳桿菌大量增殖,在16 d數量達到1.62×107CFU/mL,隨后開始下降,這是因為隨著發(fā)酵時間的延長,發(fā)酵基質酸度的升高(圖2)、營養(yǎng)物質的消耗以及微生物代謝廢物的產生抑制了植物乳桿菌的生長繁殖[25]。NF組植物乳桿菌數量在16 d也有明顯增加,隨后緩慢減少,在IF組植物乳桿菌數量達到峰值(16 d)時,兩組植物乳桿菌數量相差兩個數量級以上,此時IF組以植物乳桿菌為主要發(fā)酵微生物。

圖3 諾麗果發(fā)酵過程中植物乳桿菌的變化Fig.3 Changes in the Lactobacillus plantarumpopulations during noni fermentation

2.3 發(fā)酵過程中有機酸含量的變化

有研究表明,某些有機酸為諾麗發(fā)酵果汁提供獨特的刺激性酸味,其中辛酸和己酸為特征性有機酸[26]。為探究具體有機酸的變化情況,針對甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸和富馬酸這十種常見的有機酸進行檢測[27-28]。其中甲酸和富馬酸在兩組發(fā)酵過程中的含量均始終低于0.01 mg/mL,未在表5中展示。從表5可以看出,經過23 d強化發(fā)酵,IF組乙酸、丙酸、丁酸、己酸的含量均低于NF組,其中IF組丁酸(脂肪臭、不愉快的味道[29])含量較NF組顯著降低(P<0.05),與郝玉潔等[28]研究結果一致。在整個發(fā)酵過程中,己酸的含量最高,其中NF組30 d最高達到(16.028±0.217) mg/mL,IF組37 d最高達到(9.834±0.375) mg/mL,是諾麗果發(fā)酵果汁中的主要揮發(fā)性有機酸[30]。

2.4 發(fā)酵過程中總酚和總黃酮含量的變化

酚類物質的含量決定著發(fā)酵諾麗果汁的顏色、味道等感官特性[31]。如圖4A所示,在強化發(fā)酵過程中總酚含量先上升后下降,其中總酚含量從開始的(7.800±0.271) mg/mL在發(fā)酵23 d上升到(15.538±1.213) mg/mL,后下降到(9.157±0.174) mg/mL。這主要是因為隨著諾麗果軟化成熟,汁液滲出,果實大部分浸漬到發(fā)酵液中,有利于果肉中的多酚類化合物溶出。同時隨著發(fā)酵過程中單體酚化合物的生物合成,多酚含量也會增加,隨后總酚含量開始顯著下降(P<0.05)。

表5 諾麗果發(fā)酵過程中有機酸含量的變化Table 5 Changes in the organic acids during noni fermentation

酚類物質在諾麗鮮果中多以結合態(tài)的形式存在,而在發(fā)酵過程中,其在微生物及各種酶的多重作用下,將大分子轉化成小分子并釋放進入諾麗發(fā)酵果汁中[32]。酚類物質的氧化與溶出也是同時進行的,到了發(fā)酵后期,溶出的速率降低,而氧化過程仍在繼續(xù),導致酚類呈現緩慢的下降趨勢[33]。

總黃酮含量的變化趨勢(圖4B)與總酚含量的變化相似,在IF組中其含量也是在23 d達到0.542 mg/mL,略高于晏永球[13]檢測到諾麗果自然發(fā)酵過程的總黃酮含量峰值0.49 mg/mL。但是在后續(xù)的發(fā)酵過程中總黃酮含量下降不明顯,NF組仍保持整體呈上升趨勢。這可能是由于隨著果肉浸漬,黃酮類化合物從果中滲出導致總黃酮含量上升。

圖4 諾麗果發(fā)酵過程中總酚和總黃酮含量的變化Fig.4 Changes in total polyphenol contentsand total flavonoids contents during noni fermentation

2.5 發(fā)酵過程中主要單體植物素成分含量的變化

蘆丁、槲皮素和東莨菪素是諾麗果中被關注較多的功能性植物素[34]。現代研究認為蘆丁具有降低毛細血管的異常通透性和脆性的作用,是心血管疾病制劑的主要成分[35];槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗菌、抗病毒等作用[36];東莨菪素是香豆素類衍生物,具有良好的抗氧化和抗真菌作用[18],有研究表明這三種植物素的含量與品種密切相關,不同品種的諾麗果發(fā)酵液含量差異明顯[34]。由圖5可知,新鮮諾麗果中蘆丁的含量為(112.123±4.903) μg/g,經37 d發(fā)酵IF組降低到(47.434±3.574) μg/g,NF組降低到(52.826±2.873) μg/g,這可能是由于隨著發(fā)酵的進行蘆丁轉化為其他小分子物質[37];槲皮素的含量從(2.462±4.903) μg/g上升到(15.534±3.574) μg/g,雖然低于NF組(19.009±2.873) μg/g,但與新鮮諾麗果相比,仍顯著上升(P<0.05)。經過相關性分析,發(fā)酵過程中蘆丁含量與槲皮素含量呈極顯著相關(相關系數r=0.99),由圖6可知,蘆丁和槲皮素的結構僅差一個側鏈上的鼠李糖基,槲皮素含量的增加可能是因為蘆丁在發(fā)酵過程中水解,這與目前關于利用微生物轉化制備槲皮素的研究情況相符[38]。東莨菪素的含量在發(fā)酵過程中整體呈下降趨勢,在發(fā)酵23 d時,IF組東莨菪素的含量更高,經分析IF組東莨菪素含量與槲皮素含量顯著相關(r=0.977),NF組東莨菪素含量與槲皮素(r=0.975)和蘆丁(r=0.974)含量均顯著相關。

圖5 諾麗果發(fā)酵過程中主要單體植物素成分含量的變化Fig.5 Changes in the content of major monomerphytochemicals during noni fermentation

圖6 主要單體植物素的化學結構Fig.6 Structural formula of major monomer phytochemicals

2.6 發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的變化

如圖7所示發(fā)酵過程中的總抗氧化能力、DPPH自由基清除率和羥自由基清除率均大體呈現先上升再下降的趨勢。強化發(fā)酵過程中,總抗氧化能力、對DPPH自由基、羥自由基的清除率均在23 d達到最高,其中總抗氧化能力由初始的(1.23±0.08) mmol/L達到(1.82±0.13) mmol/L,DPPH自由基清除率由61.69%±1.20%最高達到84.76%±3.43%,羥自由基清除率由79.12%±2.02%最高達到94.41%±1.07%,較諾麗鮮果汁均有顯著提高(P<0.05),且抗氧化能力最高值均高于NF組。這可能與諾麗果發(fā)酵過程中活性物質的變化情況與乳酸菌代謝產物作用有關[23,39]。綜上,諾麗果經23 d強化發(fā)酵,果汁的抗氧化能力有了明顯改善。

圖7 諾麗果發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的變化Fig.7 Changes in antioxidant activity during noni fermentation

2.7 發(fā)酵過程中抗氧化活性與總酚、總黃酮及三種植物素含量的相關性分析

諾麗果強化發(fā)酵23 d時,總酚、總黃酮含量及體外抗氧化能力最高,因此選擇此時作為強化發(fā)酵的發(fā)酵終點。由表6可知,在NF組中,對DPPH自由基的清除能力與其蘆丁含量呈顯著相關(P<0.05),與總黃酮含量呈極顯著相關(P<0.01);在IF組中,對DPPH自由基的清除能力與其所含總酚和蘆丁含量呈顯著相關(P<0.05),與總黃酮呈極顯著相關(P<0.01)。綜合看來,發(fā)酵過程中NF、IF組的總抗氧化能力和羥自由基清除率與總酚、總黃酮及三種植物素含量均無顯著相關性,NF與IF組總抗氧化能力的差距可能是其他活性物質或植物乳桿菌代謝產物作用的結果;DPPH自由基清除率與總黃酮含量相關極顯著(P<0.01),與蘆丁含量顯著相關(P<0.05),由于強化發(fā)酵23 d時總黃酮含量更高,得到的果汁對DPPH自由基的清除能力更強,此外,由圖5(A)可知蘆丁的含量隨發(fā)酵時間延長逐漸減少,因此為了得到清除DPPH自由基能力強的諾麗發(fā)酵果汁,不宜發(fā)酵過長時間。綜上,通過23 d強化發(fā)酵可以得到抗氧化能力更高的諾麗果汁。

表6 諾麗果發(fā)酵過程中抗氧化活性與總酚、總黃酮及主要單體植物素含量變化間的相關性Table 6 Correlation between antioxidant activity and thecontent of total phenols,total flavonoids and majormonomer phytochemicals during noni fermentation

3 結論

實驗通過自然發(fā)酵與強化發(fā)酵諾麗果的對比,研究諾麗果汁發(fā)酵過程中關鍵理化性質、有機酸、活性成分以及體外抗氧化活性等的變化規(guī)律,結果表明通過23 d強化發(fā)酵的諾麗果汁總酚、總黃酮、槲皮素含量均有顯著增加(P<0.05),給諾麗果汁帶來強烈刺激性酸味的丁酸含量顯著降低(P<0.05),從而減輕了果汁的強烈刺激性。與新鮮諾麗果汁相比,經23 d強化發(fā)酵,果汁的抗氧化能力也有顯著提升(P<0.05)。本文以諾麗果為發(fā)酵基質,首次采用植物乳桿菌進行強化發(fā)酵,得到了活性成分較高、風味較為柔和且抗氧化能力強的諾麗果發(fā)酵汁。