離子液體輔助雙水相系統(tǒng)提取茶渣中茶多酚工藝優(yōu)化

龔新懷,2,李明春2,辛梅華2,趙曉杰,呂 橄,徐 婕，趙升云

(1.武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院,福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建武夷山 354300;2.華僑大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,環(huán)境友好功能材料教育部工程研究中心,福建廈門(mén) 361021)

目前全球每年茶葉消耗量超過(guò)450萬(wàn)噸[1]。在茶葉種植、生產(chǎn)、加工及消費(fèi)環(huán)節(jié)中會(huì)產(chǎn)生大量的茶渣剩余物,單中國(guó)每年可產(chǎn)生500萬(wàn)噸以上的茶渣剩余物,其主要含有纖維素、木質(zhì)素、半纖維素及茶多酚等活性組分[2]。茶多酚作為一種天然抗氧劑,具有抗癌癥、抗衰老及預(yù)防冠心病等作用,在保健品、化妝品、塑料工業(yè)及疾病治療等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景[3-6]。目前主要通過(guò)溶劑回流浸提茶葉來(lái)獲取茶多酚,但該工藝存在溶劑用量大、提取溫度偏高及后續(xù)需進(jìn)一步純化操作等問(wèn)題[7]。

雙水相系統(tǒng)(ATPS)是由兩種不相容的親水組分溶于水中,形成宏觀上可見(jiàn)的液液分相系統(tǒng),被視為一種功能強(qiáng)大的非色譜過(guò)程,具有工藝簡(jiǎn)單、成本低、易放大操作及條件溫和等優(yōu)勢(shì),適用于蛋白質(zhì)、核酸及抗體等生物活性分子的萃取、純化[8-10]。目標(biāo)組分與ATPS中上下兩相通過(guò)電荷力、氫鍵及疏水作用等方式形成的親和力大小不同,進(jìn)而在ATPS上下兩相發(fā)生選擇性分配,實(shí)現(xiàn)萃取、純化[11]。徐方祥等[12]采用微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取綠茶中茶多酚。陳鋼等[13]采用超聲耦合乙醇-硫酸銨組成的雙水相體系提取茶多酚,并對(duì)工藝進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化。林維晟等[14]采用微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相的方法對(duì)碎銅茶中茶多酚進(jìn)行提取。

此外,為促進(jìn)目標(biāo)組分在ATPS對(duì)應(yīng)相中的富集,研究者主要通過(guò)改變相組成物質(zhì)分子量和濃度來(lái)調(diào)節(jié)上下相的性質(zhì),調(diào)控其與目標(biāo)組分的親和力,調(diào)控手段較單一、作用效果有限。離子液體(ionic liquid,IL)是一類(lèi)由體積較大的有機(jī)陽(yáng)離子和有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子組合成的,在100 ℃以下為液體的鹽[15],具有低揮發(fā)、無(wú)毒性等優(yōu)勢(shì),可通過(guò)不同結(jié)構(gòu)和電荷性質(zhì)的陰陽(yáng)離子組合,來(lái)溶解許多不同極性大小和特點(diǎn)的組分[16]。研究表明[17-18],將IL作為一種調(diào)節(jié)助劑添加到ATPS中,可調(diào)節(jié)上下相的物化性質(zhì),提高其對(duì)目標(biāo)組分的萃取能力和適用范圍。Joao等[19]將咪唑基離子液體添加于聚乙二醇/磷酸鉀雙水相體系,用于提取抗氧化劑丁香酚和沒(méi)食子酸丙酯,發(fā)現(xiàn)離子液體添加可以提高雙水相體系的萃取效率。Almeida等[18]將離子液體添加于聚乙烯醇/硫酸鈉雙水相體系中,用于3種抗氧化組分沒(méi)食子酸、香草酸及丁香酸的萃取。發(fā)現(xiàn)離子液體[C4mim]Cl或[C4mim][CH3CO2]的添加顯著提高了雙水相體系對(duì)沒(méi)食子酸的萃取能力,并可實(shí)現(xiàn)對(duì)3種組分良好的萃取分離。

因此將離子液體添加到傳統(tǒng)雙水相體系中,有助于茶多酚的提取、純化過(guò)程,但這方面研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用離子液體(ionic liquids,IL)輔助乙醇/硫酸銨ATPS來(lái)提取茶渣中茶多酚,系統(tǒng)考察了不同結(jié)構(gòu)ILs對(duì)乙醇/硫酸銨ATPS分相行為及其對(duì)茶多酚浸提能力等的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶渣,綠碎茶加工下腳料 湖北隨州神農(nóng)茶葉有限公司,用前晾干,并在105 ℃下鼓風(fēng)干燥12 h,機(jī)械研磨,用標(biāo)準(zhǔn)分樣篩取用粒徑<300 μm的茶粉備用;硫酸銨、無(wú)水乙醇、七水合硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀 AR，國(guó)藥試劑;沒(méi)食子酸、1,1-二苯基-2-苦基肼及抗壞血酸 上海源葉生物科技有限公司,HPLC含量≥98%;1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C4mim]BF4)、溴化1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim]Br)、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽([C4mim]NO3)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C4mim]PF6)、氯化1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim]Cl)、1-丁基-1-甲基哌啶氯化物([C4mpip]Cl)、1-丁基-1-甲基吡咯烷酰氯([C4mpyr]Cl)、氯化1-己基-3-甲基咪唑([C6mim]Cl)及氯化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Cl) 上海程捷化學(xué)有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%。

1000Y型多功能粉碎機(jī) 永康市伯歐五金制品有限公司;S10H型超聲波清洗機(jī) 廈門(mén)致微儀器有限公司;SC-04型低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;ΜV-1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;1260型高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 IL輔助ATPS提取茶渣中茶多酚 吸取一定量乙醇溶液,加入預(yù)定質(zhì)量的硫酸銨及IL,超聲(功率為270 W)輔助溶解15 min后,再取出靜置分相10 min,然后讀取、記錄上下相的體積,即得到IL輔助的乙醇/硫酸銨ATPS。另取一只干凈、干燥的塑料離心管,加入預(yù)定質(zhì)量的茶渣,然后加入前述配制好的IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS,超聲水浴提取至預(yù)定時(shí)間后,轉(zhuǎn)入離心機(jī)中在4000 r/min下離心10 min,茶多酚富集于上層乙醇相清液中,待測(cè)定其濃度。平行操作2份,取平均值。

1.2.2 IL的選擇

圖1 不同IL的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of ILs注:(a)[C4mim]BF4;(b)[C4mim]Br;(c)[C4mim]PF6;(d)[C8mim]Cl;(e)[C4mim]NO3;(f)[C4mim]Cl;(g)[C6mim]Cl;(h)[C4mpyr]Cl;(i)[C4mpip]Cl。

1.2.2.1 不同結(jié)構(gòu)IL篩選 通過(guò)IL中不同陰陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)的選用與組合,得到不同親疏水性的IL,可調(diào)控雙水相體系的分相行為及其對(duì)活性組分的萃取分離能力,實(shí)現(xiàn)對(duì)各種物化性質(zhì)不同的目標(biāo)組分進(jìn)行提取或純化。為考察不同結(jié)構(gòu)組成IL對(duì)乙醇/硫酸銨ATPS的分相行為及其對(duì)茶多酚得率影響,試驗(yàn)選用了9種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)IL,分別為1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C4mim]BF4)、溴化1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim]Br)、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽([C4mim]NO3)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C4mim]PF6)、氯化1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim]Cl)、1-丁基-1-甲基哌啶氯化物([C4mpip]Cl)、1-丁基-1-甲基吡咯烷酰氯([C4mpyr]Cl)、氯化1-己基-3-甲基咪唑([C6mim]Cl)及氯化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Cl),其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.2.2.2 不同IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS的分相能力 a.乙醇/硫酸銨相圖繪制(即對(duì)照組):參照盧艷敏[20]的方法,采用濁點(diǎn)滴定法繪制ATPS相圖。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的硫酸銨溶液,量取25.00 g于刻度容器內(nèi),置于25 ℃的恒溫水浴鍋中。緩慢滴加無(wú)水乙醇,至其恰好出現(xiàn)渾濁時(shí)停止滴加,記錄此時(shí)乙醇加入量,計(jì)算硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù);滴加少量去離子水使體系澄清,記錄水加入質(zhì)量,再繼續(xù)滴加無(wú)水乙醇至濁點(diǎn)剛好出現(xiàn)。如此反復(fù)操作和計(jì)算,得到一系列不同組成的濁點(diǎn)。

b.不同IL輔助乙醇/硫酸銨相圖繪制:按a法準(zhǔn)備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的硫酸銨溶液、無(wú)水乙醇及水,并分別在其中加入1.25 g的[C4mim]Cl,得到含[C4mim]Cl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的硫酸銨溶液、無(wú)水乙醇及水。其余按a法操作,即得到含[C4mim]Cl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濁點(diǎn)曲線。同法可繪制含其他不同化學(xué)結(jié)構(gòu)IL的濁點(diǎn)曲線。

c. 不同IL添加量輔助乙醇/硫酸銨相圖繪制:按b法繪制含[C4mim]Cl質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、5%、10%及15%的乙醇/硫酸銨濁點(diǎn)曲線。

1.2.2.3 不同IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS體系對(duì)茶多酚得率和抗氧化性的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%,茶渣與IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS的料液比為1∶35 g/mL(簡(jiǎn)寫(xiě)成1∶35),IL添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%條件下,考察不同結(jié)構(gòu)IL添加對(duì)茶多酚得率及對(duì)抗氧化性的影響,其中抗氧化性測(cè)試是利用茶多酚提取液對(duì)1×10-4mol·L-1的1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)的半抑制濃度為指標(biāo),并以無(wú)水乙醇替代試液作為初始對(duì)照值。

1.2.2.4 [C4mim]Cl用量對(duì)茶多酚得率和抗氧化性的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%,料液比1∶35,考察[C4mim]Cl添加量對(duì)茶多酚得率和抗氧化性的影響,其中抗氧化性測(cè)試同1.2.2.3。

1.2.3 [C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS提取茶多酚工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取茶多酚工藝的影響 固定[C4mim]Cl添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%,料液比1∶35,溫度45 ℃,提取時(shí)間10 min,超聲功率540 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%和70%時(shí),考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茶多酚得率的影響。

1.2.3.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取茶多酚工藝的影響 固定[C4mim]Cl添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,料液比為1∶35,溫度45 ℃,提取時(shí)間10 min,超聲功率540 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、20%、25%、30%、35%及40%時(shí),考察硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)茶多酚得率的影響。

1.2.3.3 料液比對(duì)提取茶多酚工藝的影響 固定[C4mim]Cl添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%,提取溫度45 ℃,提取時(shí)間10 min,超聲功率540 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,料液比為1∶25、1∶35、1∶45、1∶55及1∶65 (g/mL)時(shí),考察料液比對(duì)茶多酚得率的影響。

1.2.3.4 提取溫度對(duì)提取茶多酚工藝的影響 固定[C4mim]Cl添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%,料液比為1∶35,提取時(shí)間10 min,超聲功率540 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,溫度為35、40、45、50及55 ℃時(shí),考察提取溫度對(duì)茶多酚得率的影響。

1.2.3.5 提取時(shí)間對(duì)提取茶多酚工藝的影響 固定[C4mim]Cl添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%,料液比為1∶35,提取溫度為50 ℃,超聲功率540 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,提取時(shí)間為5、10、15、20及25 min時(shí),考察提取時(shí)間對(duì)茶多酚得率的影響。

1.2.3.6 超聲功率對(duì)提取茶多酚工藝的影響 固定[C4mim]Cl添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%,料液比為1∶35,提取溫度為50 ℃,提取時(shí)間10 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,超聲功率為360、450、540、630及720 W時(shí),考察超聲功率對(duì)茶多酚得率的影響。

1.2.4 [C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS提取茶多酚工藝的正交試驗(yàn) 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以茶多酚得率為指標(biāo),采用正交試驗(yàn)法對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比及超聲功率四個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化,正交優(yōu)化因素及水平如表1所示,固定[C4mim]Cl添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。

表1 正交優(yōu)化因素選擇Table 1 Factor design of orthogonal experiment

1.2.5 不同體系對(duì)茶多酚得率及組成的影響

1.2.5.1 不同體系對(duì)茶多酚得率的影響 實(shí)驗(yàn)比較0.10 g·mL-1的[C4mim]Cl輔助C2H5OH/(NH4)2SO4ATPS與其他提取體系如水、50%乙醇溶液、PEG6000/Na3C6H5O7ATPS、C2H5OH/Na2HPO4ATPS、C2H5OH/(NH4)2SO4ATPS、PEG6000/Na3C6H5O7/[C4mim]Cl ATPS對(duì)茶多酚得率的差別,其中乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%及鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%,超聲溫度45 ℃、超聲時(shí)間10 min、超聲功率540 W、料液比1∶35。茶多酚得率測(cè)定見(jiàn)1.2.6。

1.2.5.2 茶多酚提取液組成分析 參照國(guó)標(biāo)GB/T 8313-2008[21]方法,采用HPLC測(cè)定茶渣多酚提取液的組成。色譜條件:色譜柱C18柱(粒徑5 μm,250 mm×4.6 mm);將10 mL乙酸轉(zhuǎn)入1000 mL容量瓶,用純凈水定容后,過(guò)0.45 μm濾膜,得流動(dòng)相A;將800 mL乙腈、10 mL乙酸轉(zhuǎn)入1000 mL容量瓶中,用純凈水定容后,過(guò)0.45 μm濾膜,得流動(dòng)相B。梯度條件:0 min(5%B)→21 min(85%B)→32 min(100%B)→37 min(0%B)→42 min(0%B)。檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm,流動(dòng)相流速1 mL·min-1。

定性及定量分析方法:參照文獻(xiàn)[22],定性及定量分析組分峰:兒茶素(保留時(shí)間5.36 min)、表兒茶素(保留時(shí)間7.41 min)、沒(méi)食子兒茶素(保留時(shí)間4.37 min)、表兒茶素表沒(méi)食子酸酯(保留時(shí)間8.98 min)及表沒(méi)食子兒茶素表沒(méi)食子酸酯(保留時(shí)間7.12 min)。用HPLC儀器自帶分析軟件對(duì)組分峰面積進(jìn)行積分,根據(jù)其峰面積算出對(duì)應(yīng)組分含量。

1.2.6 提取液中茶多酚得率和抗氧化性的測(cè)定

1.2.6.1 提取液中茶多酚濃度測(cè)定 采用沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線法,按國(guó)標(biāo)GB/T 8313-2002[23]測(cè)定上相清液中茶多酚的濃度,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.09245x+0.02482,R2=0.9993。用移液槍移取上層清液1.00 mL于25.00 mL比色管中,加去離子水4.00 mL,酒石酸亞鐵溶液5.00 mL,充分混勻后,加入pH=7.5的緩沖液至刻度線,定容。然后用1.00 cm比色皿在波長(zhǎng)540 nm下測(cè)定吸光度,以試劑空白為參比。

1.2.6.2 提取液中茶多酚得率計(jì)算 按下式計(jì)算茶多酚得率。

式中:c為ATPS上層清液中茶多酚的濃度,mg·mL-1;v為ATPS上層清液的體積,mL;m為稱(chēng)取的茶渣質(zhì)量,g。

1.2.6.3 茶多酚提取液抗氧化性測(cè)定 參照李曉靜等[24]的方法,配制1×10-4mol·L-1的1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)溶液后,分別取5.00 mL茶多酚提取液和DPPH溶液,于暗處混勻并靜置30 min,然后將混合液在紫外分光光度儀上于517 nm測(cè)定吸光度,以無(wú)水乙醇替代試液作為初始對(duì)照值。使DPPH溶液吸光度值下降一半時(shí)對(duì)應(yīng)的茶多酚濃度,即為茶多酚提取液對(duì)DPPH自由基的半抑制濃度,記錄為C50%(DPPH),用作茶多酚的抗氧化性指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試過(guò)程的數(shù)據(jù)記錄,及儀器測(cè)試數(shù)據(jù)導(dǎo)出后,將其錄入到Origin軟件中,用Origin軟件繪制曲線及圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 IL在乙醇/硫酸銨ATPS體系中的選擇

2.1.1 IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS的分相行為 IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS的相圖如圖2所示,其中溫度為298 K。由于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較多,以及部分試劑采購(gòu)量較少,量不足以完成相圖繪制,因此只做了6種不同IL輔助乙醇/硫酸銨雙水相系統(tǒng)的相圖。圖2中濁點(diǎn)線上方為兩相區(qū)域,下方為單相區(qū)域。兩相區(qū)域越大,表示雙水相體系中上下兩相之間的分相能力越強(qiáng)[18]。由圖2a可知,不同IL的加入,明顯增大了兩相區(qū)域面積,其中以[C4mim]Cl的輔助分相能力最好。由圖2b可知,隨[C4mim]Cl用量增加,乙醇與硫酸銨雙水相體系的兩相區(qū)域面積越大。由此可知IL加入提高了乙醇/硫酸銨ATPS的分相能力。這是由于[C4mim]Cl是由有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)陰離子組成,比乙醇具有更高的親水性,可與更多的水分子發(fā)生水合作用,導(dǎo)致乙醇分子更容易被驅(qū)離成相,提高體系的分相能力[25]。

圖2 IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS的相圖Fig.2 Phase diagrams of C2H5OH/(NH4)2SO4 ATPS added with ILs注：(a)不同類(lèi)型ILs;(b)不同添加量[C4mim]Cl。

2.1.2 IL化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)茶多酚得率和抗氧化性的影響

2.1.2.1 IL化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)茶多酚得率的影響 不同化學(xué)結(jié)構(gòu)IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS對(duì)茶多酚得率及其抗氧化性的影響見(jiàn)圖3和圖4。由圖3可知,未添加IL的ATPS對(duì)茶渣(tea waste,TW)中茶多酚得率僅為42.11±0.55 mg·g-1,IL的添加不同程度提高了茶多酚得率。這是由于在乙醇/硫酸銨ATPS中,上相為乙醇富集相,下相為鹽富集相,茶多酚傾向分布在更加疏水和低電荷的乙醇富集相中。ATPS對(duì)目標(biāo)組分能夠?qū)崿F(xiàn)有效萃取、富集,主要是兩相中組分與目標(biāo)組分各種作用力的平衡結(jié)果,這種作用驅(qū)動(dòng)力包括疏水作用、氫鍵、靜電作用以及π-π鍵共軛作用等,能夠強(qiáng)化這種驅(qū)動(dòng)力的手段就能夠促進(jìn)目標(biāo)組分在對(duì)應(yīng)相中的富集[17]。如IL中陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)可與茶多酚形成氫鍵,咪唑環(huán)上π電子可以和茶多酚的π電子發(fā)生π-π共軛作用,促進(jìn)茶多酚在乙醇相中的富集[18]。此外,IL中陰離子基團(tuán)可以接受茶多酚中的質(zhì)子等[26],有利于茶多酚組分的溶出及被乙醇相富集,提高茶多酚得率[17]。

對(duì)于IL中陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)而言(如圖3a所示),咪唑環(huán)陽(yáng)離子相比于哌啶型和吡咯型IL,具有更高的茶多酚得率,這主要是由于咪唑環(huán)屬于芳香環(huán),具有π電子可以和茶多酚發(fā)生π-π電子共軛作用,此外咪唑環(huán)上含有兩個(gè)N原子,與茶多酚組分形成的氫鍵作用更大[18]。咪唑環(huán)上的側(cè)鏈越長(zhǎng),其疏水性增加,對(duì)中性的茶多酚分子具有更高的親和性[25]。對(duì)于吡咯環(huán)和哌啶環(huán)兩個(gè)非芳香性的環(huán),六元環(huán)的哌啶環(huán)具有更高的疏水性,從而對(duì)中性茶多酚分子具有更高的親和性。但由于[C4mim]Cl性?xún)r(jià)比最高,因此后續(xù)選擇[C4mim]Cl。此外從圖3b可知,固定陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)為[C4mim],IL中不同陰離子結(jié)構(gòu)對(duì)茶多酚得率影響大小順序?yàn)?Br>BF4>Cl>NO3>PF6。且IL中陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)變化對(duì)茶多酚得率的影響要大于陰離子結(jié)構(gòu)變化的影響。

圖3 IL化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)茶多酚得率的影響Fig.3 Effects of ILs chemical structureson the extraction yields of polyphenols注:(a)IL中不同陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)的影響;(b)IL中不同陰離子結(jié)構(gòu)的影響;圖4同。以no IL數(shù)據(jù)為對(duì)照組，與之相比，*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),未標(biāo)注表示差異不顯著;圖4、表5同。

2.1.2.2 IL化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)茶多酚抗氧化性的影響 不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的IL添加對(duì)茶多酚提取物的抗氧化活性影響如圖4所示。未添加IL時(shí),乙醇/硫酸銨雙水相體系提取的茶多酚對(duì)DPPH自由基作用30 min時(shí)的半抑制濃度僅為1.43 μg·mL-1,表明茶多酚具有高效的抑制自由基能力,具有良好的抗氧化、抗老化作用。IL輔助后的茶多酚提取物對(duì)DPPH自由基的半抑制濃度雖有微弱升高,但都呈現(xiàn)為很低的濃度值(<2.00 μg·mL-1),說(shuō)明試驗(yàn)選用的IL對(duì)茶多酚的抗氧化活性幾乎沒(méi)有抑制作用。

圖4 IL化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)多酚提取液抗氧化性的影響Fig.4 Effects of ILs chemical structureson the antioxidant properties of the extraction

IL的加入雖然可以改變給定相的理化性質(zhì),調(diào)節(jié)其對(duì)目標(biāo)組分的萃取或純化能力,但由于IL通常成本較高,因此少量添加比較合適。綜合考慮IL添加成本及輔助作用(如表2所示),其中價(jià)格/性能比值由25 g售價(jià)/茶多酚得率來(lái)簡(jiǎn)單估算,比值越小越好。由表2數(shù)據(jù)可知,[C4mim]Cl輔助的比值最小,因此后續(xù)試驗(yàn)選擇[C4mim]Cl為添加輔助劑。

表2 不同離子液體性?xún)r(jià)比的比較Table 2 Comparison of cost and performance of ILs

2.1.3 [C4mim]Cl用量對(duì)茶多酚得率和抗氧化性的影響 [C4mim]Cl添加量對(duì)茶多酚得率和抗氧化性的影響結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,隨[C4mim]Cl用量增加,茶多酚得率逐漸提高,在[C4mim]Cl添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí),茶多酚得率為75.52±0.75 mg·g-1,比未添加ILs時(shí)提高了79.34%。[C4mim]Cl添加并未影響茶多酚提取液的抗氧化性,提取液對(duì)DPPH自由基半抑制濃度保持在很低的濃度值范圍(<2.00 μg·mL-1)。茶多酚在酸性環(huán)境中具有很好的穩(wěn)定性,在乙醇/硫酸銨ATPS中,硫酸銨的存在使體系能夠維持弱酸性環(huán)境,保證了茶多酚提取液的活性。

圖5 [C4mim]Cl添加量對(duì)體系提取茶多酚的影響Fig.5 Effects of [C4mim]Cl contenton the extraction properties of polyphenol注:(a)茶多酚得率;(b)茶多酚提取液的抗氧化性。

2.2 [C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS提取茶多酚工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取茶多酚工藝的影響 隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加,體系對(duì)茶多酚得率先增后減,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)達(dá)到最大(如圖6a所示)。乙醇用量增加,可與更多茶多酚組分發(fā)生作用,有助于茶多酚浸提,但用量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致其他組分如蛋白質(zhì)、多糖等沉淀,吸附部分茶多酚[27],降低其茶多酚得率。

2.2.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取茶多酚工藝的影響 硫酸銨用量增加,其鹽析作用增強(qiáng),使更多乙醇分子聚集而為醇相,對(duì)茶多酚提取能力提高。但鹽過(guò)多會(huì)吸附水而使乙醇相體積變小,對(duì)茶多酚得率下降[28]。因此硫酸銨最佳添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%(如圖6b所示)。

2.2.3 料液比對(duì)提取茶多酚工藝的影響 隨ATPS用量增加,茶多酚得率先增大后減小,在料液比為1∶35時(shí)最大(圖6c)。這是由于體系用量增大,其對(duì)茶粉的滲透作用更充分,使內(nèi)部的茶多酚被浸提出來(lái);但溶劑用量過(guò)多,會(huì)導(dǎo)致部分多糖、蛋白質(zhì)沉析,會(huì)吸附部分茶多酚使多酚得率下降。

2.2.4 提取溫度對(duì)提取茶多酚工藝的影響 提取溫度增加,溶劑分子活動(dòng)能力增強(qiáng),有利于體系對(duì)茶粉中茶多酚組分的浸提作用,茶多酚得率提高(如圖6d)。但溫度提高也會(huì)使茶多酚的穩(wěn)定性下降[29]。因此綜合考慮,[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨雙水相體系提取茶多酚的適宜溫度為50 ℃。

2.2.5 提取時(shí)間對(duì)提取茶多酚工藝的影響 隨體系提取茶渣時(shí)間的延長(zhǎng),茶多酚得率先快速增加,然后變緩慢并趨于平衡(如圖6e所示)。浸提時(shí)間延長(zhǎng),可使體系對(duì)茶粉中茶多酚發(fā)生更充分的浸提,當(dāng)浸提時(shí)間延長(zhǎng)到10 min以后,雙水相體系對(duì)茶多酚的浸提作用基本達(dá)到極限,因此表現(xiàn)為茶多酚得率趨于平衡。因此提取適宜時(shí)間為10 min。

2.2.6 超聲功率對(duì)提取茶多酚工藝的影響 隨超聲功率增加,茶多酚得率先增加后減小,在超聲功率為540 W時(shí)得率最高。這是由于超聲功率增強(qiáng),體系對(duì)茶粉的振蕩作用加強(qiáng),有利于其對(duì)茶多酚的浸提作用。但超聲功率過(guò)強(qiáng),可能會(huì)使茶粉中部分多糖、蛋白質(zhì)等沉析出來(lái),反而降低了茶多酚得率。

圖6 不同因素對(duì)[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS提取茶多酚工藝的影響Fig.6 Effects of single factors on extraction of polyphenol by C2H5OH/(NH4)2SO4 ATPS added with[C4mim]Cl注:(a)乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響;(b)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響;(c)料液比的影響;(d)提取溫度的影響;(e)提取時(shí)間的影響;(f)超聲功率的影響。

2.3 茶多酚提取工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化

基于2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以茶多酚得率為指標(biāo),用正交試驗(yàn)法對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比及超聲功率四個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如表3及表4所示。從表4可知,對(duì)茶多酚得率影響大小順序依次是乙醇體積分?jǐn)?shù)>硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)>料液比>超聲功率,最佳因素組合為A2B2C3D2,即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%、料液比1∶40和超聲功率540 W,此條件下,平行結(jié)果分別為87.54、83.78、84.98及85.33 mg·g-1,平均值85.31±1.25 mg·g-1。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment

2.4 不同體系提取茶多酚得率比較

實(shí)驗(yàn)比較了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS與其他提取體系,結(jié)果如表5所示。其中乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%及鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%,超聲溫度45 ℃、超聲時(shí)間10 min、超聲功率540 W、料液比1∶35。從表5可知,水浸提茶多酚得率僅為31.37±0.09 mg·g-1,有機(jī)溶劑乙醇的加入使茶多酚得率提高至39.61±1.41 mg·g-1,當(dāng)乙醇溶液與無(wú)機(jī)鹽組成ATPS后,茶多酚得率提高至42.11±0.55 mg·g-1,表明ATPS是一種具有較高效率的茶多酚提取方法。而離子液體[C4mim]Cl的加入,極顯著提升了ATPS對(duì)茶多酚的得率(P<0.01),在[C4mim]Cl輔助乙醇/磷酸氫二鈉及聚乙二醇2000/檸檬酸鈉ATPS中,同樣可看到IL添加對(duì)ATPS體系提取茶多酚得率有明顯改善作用。表明IL輔助雙水相體系提取茶多酚方法具有明顯優(yōu)勢(shì)。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 4 Analysis results of orthogonal experiment

表5 不同體系提取茶渣多酚提取液中兒茶素成分含量比較Table 5 Comparison in yields of polyphenol extracted by different methods

2.5 茶多酚提取液組成分析

[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS與其他體系提取茶渣多酚提取液的HPLC譜圖如圖7所示,其中[C4mim]Cl質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。由于組分Na2HPO4、Na3C6H5O7存在使體系呈堿性,會(huì)使茶多酚變性,喪失活性,而組分(NH4)2SO4存在可使體系呈弱酸性,對(duì)茶多酚活性無(wú)損傷。因此僅研究了水、50%乙醇溶液、乙醇/硫酸銨ATPS及[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS四種系統(tǒng)對(duì)茶多酚提取液的組成。從圖7中可知,水、50%乙醇溶液、乙醇/硫酸銨ATPS及[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS對(duì)茶渣多酚提取液的HPLC譜圖中各峰保留時(shí)間基本一致,但各峰的峰高及峰面積存在差異。峰位置不同,代表不同組分,峰面積大小及其百分比則代表了該組分的含量。茶渣多酚提取液中主要含有茶多酚及咖啡因(CAF)等組分,茶多酚主要成分為兒茶素類(lèi)物質(zhì),其是由兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、沒(méi)食子兒茶素(GC)、表兒茶素表沒(méi)食子酸酯(ECG)及表沒(méi)食子兒茶素表沒(méi)食子酸酯(EGCG)等組成,各種兒茶素成分的保留時(shí)間[22]如表6所示。[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS與其他體系提取茶渣多酚提取液中主要成分含量的測(cè)定結(jié)果如圖7、表6及表7所示。

表7 不同體系提取茶渣多酚提取液中兒茶素成分含量比較(%)Table 7 Comparison of the catechin content in extraction of polyphenol extracted by different methods(%)

圖7 不同體系提取茶渣中多酚提取液的HPLC譜圖Fig.7 HPLC spectrums of the extraction ofpolyphenol extracted by different methods

表6 茶渣提取液中主要成分及其保留時(shí)間Table 6 The main components in theextraction and it’s retention time

從表7中數(shù)據(jù)可知,水溶劑提取法對(duì)茶多酚的萃取能力最弱,其提取液中各種組分含量也最低。有機(jī)溶劑乙醇的加入,使其提取茶多酚能力有所提高,各種組分含量也有所增加。無(wú)機(jī)鹽分硫酸銨的加入可與乙醇溶液形成雙水相系統(tǒng),進(jìn)一步提高了體系對(duì)多酚組分的萃取能力,且提取液中兒茶素類(lèi)物質(zhì)組分的含量有所提高。[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS對(duì)茶多酚提取能力最高,其對(duì)茶渣的提取液中各種兒茶素類(lèi)物質(zhì)組分含量也最大。這主要是由于乙醇分子與茶多酚組分間作用力更強(qiáng),乙醇引入可以提高體系的提取茶多酚能力。雙水相體系作為一種液液分相的非色譜過(guò)程,可對(duì)目標(biāo)組分實(shí)現(xiàn)分配,進(jìn)行一定程度的富集作用,使組分含量和純度提高[12];[C4mim]Cl的少量輔助,通過(guò)調(diào)節(jié)乙醇/硫酸銨上下相性質(zhì),提高了ATPS的分相能力和富集茶多酚能力。將這5種兒茶素類(lèi)組分含量總和作為多酚提取液中兒茶素的總量,則可計(jì)算出[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS對(duì)茶渣的多酚提取液中兒茶素總量為25.49%,其比水溶劑、50%乙醇溶液及乙醇/硫酸銨ATPS提取液中兒茶素含量分別提高了205.27%、42.24%及11.70%。

3 結(jié)論

IL的加入使乙醇/硫酸銨ATPS相圖中的兩相區(qū)域面積增大,分相能力提高,IL加入量增加,乙醇與硫酸銨的分相能力提高。

通過(guò)對(duì)[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS茶多酚工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化考察,發(fā)現(xiàn)各因素按影響大小順序依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)>硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)>料液比>超聲功率,最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、料液比為1∶40 g/mL和超聲功率為540 W,在此條件下,茶多酚得率為85.31±1.25 mg·g-1。

IL添加對(duì)ATPS體系提取茶多酚得率有明顯改善作用,且[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS對(duì)茶渣中茶多酚得率明顯高于其他體系,其提取液中兒茶素類(lèi)組分含量更高,達(dá)到25.49%,比水溶劑、50%乙醇溶液及乙醇/硫酸銨ATPS提取液中兒茶素類(lèi)組分總量分別提高了205.27%、42.24%及11.70%。

離子液體種類(lèi)多、結(jié)構(gòu)雜,其他不同結(jié)構(gòu)組成離子液體對(duì)茶多酚得率及其影響機(jī)制,有待進(jìn)一步研究。