超聲法提取海南眼樹蓮總三萜的工藝優化及其抗氧化性

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(1.海南醫學院第一附屬醫院藥學部,海南海口 570102;2.海南醫學院藥學院,海南?？?571199)

眼樹蓮(Dischidiachinensis),別名上樹瓜子、翼魚草等,為蘿藦科眼樹蓮屬附生藤本植物,生長在低至中海拔的山地林谷或曠地,在我國其主產于海南、廣東和廣西[1]。民間將眼樹蓮全草入藥,用于清肺化痰、涼血解毒、治療眼睛疾病等[2-3]?；酐惸莸萚4]研究了眼樹蓮全株中總酚和總黃酮的體外抗氧化活性,發現眼樹蓮乙酸乙酯部位具有較強抗氧化性。楊柳等[5-7]對海南產眼樹蓮不同提取物進行了抗炎和抗腫瘤活性研究,發現眼樹蓮具有抗炎和抗腫瘤活性。余邦良等[8]對眼樹蓮乙酸乙酯萃取部位進行分離提純,首次從眼樹蓮中分離得到10個單體化合物,大部分為萜類化合物。綜上說明眼樹蓮的活性成分為萜類化合物。萜類化合物是中草藥中一類比較重要的化合物,且已經發現很多萜類化合物是中草藥的有效成分[9]。萜類化合物除了具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗瘧、抗心血管疾病、降血糖等活性外,還具有其他生物學和藥理學活性,如抗蟲、免疫調節、抗氧化、抗衰老、神經保護等[10]。

目前,植物三萜化合物提取,主要采用傳統溶劑浸提、索氏提取、溶劑回流提取法、超聲提取等方法[11]。而超聲波提取具有設備簡單、提取效率高、時間短、操作方便、節能等優點[12],本研究選取超聲波提取作為眼樹蓮總三萜的提取方法?，F已有一些關于三萜類化合物提取工藝的研究,李志等[13]利用乙醇超聲波濃縮方法提取薏苡仁中三萜類化合物,陸春菊等[14]采用乙醇超聲提取大飛揚草中三萜化合物。這些研究均以乙醇作為提取溶劑，目的是提高眼樹蓮中總三萜的提取量。目前未見眼樹蓮中總三萜提取工藝及其抗氧化活性的報道。本文通過單因素和正交優化試驗考察了溶劑種類、超聲時間、料液比、超聲功率、提取溫度等因素對提取量的影響,并對總三萜抗氧化活性進行研究,期待建立一種有效、快捷、簡單的方法來獲取更多的眼樹蓮中的總三萜,為眼樹蓮進一步在保健食品及生物醫藥等領域的進一步開發利用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮眼樹蓮 于2018年9月采自海南省海口市秀英區,海南大學劉壽柏副教授鑒定為蘿藦科植物眼樹蓮(Dischidiachinensis),編號為YSL-201809;齊墩果酸 HPLC≥98%,上海源葉生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) HPLC≥98.5%,上海麥克林生化科技有限公司;L-抗壞血酸(VC) 分析純,上海麥克林生化科技有限公司;乙酸乙酯、香草醛、高氯酸、冰醋酸 均為分析純,廣東西隴化工試劑有限公司。

722N可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;SK3210HP超聲波清洗器 上?？茖С晝x器有限公司;AE100電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HC-2518臺式高速離心機 科大創新股份有限公司;HH-60電熱恒溫水浴箱 常州國華電器有限公司;DFT-200C藥用粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;RE-2000B型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;DHG-9075A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 眼樹蓮總三萜的提取工藝 采集新鮮的海南本地眼樹蓮,切成小塊,曬干,粉碎,過40目篩,得眼樹蓮粉末2 kg。每次準確稱取眼樹蓮粉末2.00 g,置于三角瓶中,加入溶劑攪拌均勻,在一定的超聲提取時間、料液比、超聲功率和溫度條件下進行總三萜的分離,超聲完成后,抽濾得到提取液,備用[15]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 不同溶劑對眼樹蓮總三萜提取量的影響 精確稱取2.00 g眼樹蓮粉3份分成3個實驗組,分別在不同溶劑乙醇、石油醚、乙酸乙酯,料液比均為1∶30 (g/mL),超聲功率均為150 W,提取溫度均為50 ℃,提取時間均為40 min條件下,根據1.2.1項方法獲取眼樹蓮總三萜提取液,考察不同溶劑提取眼樹蓮總三萜的提取量情況[16]。

1.2.2.2 不同超聲提取時間對眼樹蓮總三萜提取量的影響 精確稱取2.00 g眼樹蓮粉末5份分成5個實驗組,分別在超聲浸提時間為20、30、40、50和60 min,均以1.2.2.1項試驗確定的溶劑,固定其他條件下,根據1.2.1項方法獲取眼樹蓮總三萜提取液,考察不同超聲提取時間對眼樹蓮總三萜的提取量情況[17]。

1.2.2.3 不同料液比對眼樹蓮總三萜提取量的影響 精確稱取2.00 g眼樹蓮粉末5份分成5個實驗組,分別在料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)下浸提,均以1.2.2.1項確定的溶劑,以1.2.2.2項確定的超聲時間,固定其他條件下,根據1.2.1項方法獲取眼樹蓮總三萜提取液,考察不同料液比對眼樹蓮總三萜的提取量情況。

1.2.2.4 不同超聲功率對眼樹蓮總三萜提取量的影響 精確稱取2.00 g眼樹蓮粉末5份分成5個實驗組,分別在超聲功率為100、150、200、250和300 W下提取,以1.2.2.1項確定的溶劑,以1.2.2.2項確定的超聲時間,以1.2.2.3項確定的料液比,固定其他條件下,根據1.2.1項方法獲取眼樹蓮總三萜提取液,考察不同超聲功率對眼樹蓮總三萜的提取量情況。

1.2.2.5 不同溫度對眼樹蓮總三萜提取量的影響 精確稱取2.00 g眼樹蓮粉末5份分成5個實驗組,分別在溫度為40、45、50、55和60 ℃下,均以1.2.2.1項確定的溶劑,均以1.2.2.2項確定的超聲時間,以1.2.2.3項確定的料液比,均以1.2.2.4項確定的超聲功率的條件下,根據1.2.1項方法獲取眼樹蓮總三萜提取液,考察不同溫度對眼樹蓮總三萜的提取量情況[18]。

1.2.3 正交試驗 以單因素實驗為基礎,考察超聲提取時間、料液比、超聲功率、溫度,采用正交試驗L9(34),正交試驗因素水平見表1,平行測定3次,求眼樹蓮中總三萜平均提取量,以總三萜提取量為評價指標,確定最佳提取工藝。

表1 眼樹蓮中總三萜提取工藝正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table for extractiontechnology of total triterpenoids from Dischidia chinensis

1.2.4 總三萜含量測定

1.2.4.1 測定波長的選擇 精確稱取齊墩果酸12.00 mg,無水乙醇為溶劑,定容于25 mL容量瓶中,配制成齊墩果酸標準溶液0.48 mg/mL。精密量取0.20 mL齊墩果酸標準溶液,置于10 mL比色管中,80 ℃水浴加熱至目測有機溶劑揮發完為止,加5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL,高氯酸0.7 mL,搖勻。在70 ℃的恒溫水浴中加熱15 min,取出用冰浴迅速冷卻至常溫,加入4 mL乙酸乙酯搖勻。以空白溶劑為參比,在400～800 nm范圍掃描其吸收光譜,確定眼樹蓮總三萜的測定波長[13,16]。

1.2.4.2 標準曲線的制作 根據1.2.4.1項中方法制備齊墩果酸儲備溶液0.48 mg/mL,用儲備溶液分別配制4、6、8、10、12、16 μg/mL的系列標準溶液。在吸收光譜的最大波長測定吸光度,以齊墩果酸系列標準溶液濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線,得到線性方程及相關系數。

1.2.4.3 總三萜提取量的計算 將1.2.1項中眼樹蓮總三萜提取液成倍稀釋后,取稀釋后溶液1 mL,在1.2.4.1項中確定的波長和方法下測定其吸光度值范圍為0.2～0.8,記錄其吸光度值,根據以下公式,計算眼樹蓮總三萜的提取量[13,15]。

總三萜提取量(mg/g)=m×c×10-3/M

式中:m:測得的吸光度在齊墩果酸標準線上顯示的齊墩果酸含量(mg);c:稀釋倍數;M:樣品質量(g)。

1.2.5 眼樹蓮中總三萜清除DPPH·能力測定 利用正交試驗優化的最佳工藝提取眼樹蓮總三萜,將其獲得的總三萜提取液在45～50 ℃旋蒸濃縮至浸膏,冷凍干燥得眼樹蓮總三萜粗品。精密稱取眼樹蓮總三萜粗品和VC(抗壞血酸),分別用無水乙醇配成0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、1.00、2.00 mg/mL系列濃度的總三萜溶液和VC溶液,備用。精密稱取20.00 mg DPPH,用無水乙醇溶解并定容為250 mL,配制成濃度為2×10-4mol/L DPPH標準溶液。量取pH6.86混合磷酸鹽緩沖液、2×10-4mol/L DPPH溶液各4 mL,加入10 mL比色管中,搖勻,分別加入不同濃度的待測總三萜溶液或VC溶液1 mL,加水至10 mL,混勻,避光,密閉反應30 min后,以未加待測溶液的溶劑為空白對照,用無水乙醇作為參比溶液,于520 nm處測定吸光度,計算清除率。每個濃度的總三萜溶液和VC溶液均測定3次,將各溶液濃度與DPPH·清除率擬合線性,觀察其線性關系,計算半數清除率IC50值[19-23]。

計算清除率公式[20]:

DPPH·清除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式中:A0為DPPH溶液本身的OD值(空白對照),A1為加入總三萜溶液或者VC溶液的DPPH溶液的OD值。

1.2.6 超聲提取法與其他提取法的比較 精確稱取眼樹蓮粉末2.00 g,固定提取時間為30 min,料液比1∶20 (g/mL),提取溫度55 ℃(傳統溶劑浸提除外),分別采用超聲提取法、傳統溶劑浸提法、索氏提取法比較3種方法提取眼樹蓮中總三萜的提取量[24]。具體實驗參數見表2。

表2 3種提取方法實驗具體實驗參數Table 2 Experimental parameters ofthree kinds of extraction methods

1.3 數據處理

每組實驗處理設置3次重復。使用軟件Microsoft Excel 2016和SPSS 19.0進行數據分析與統計。

2 結果與分析

2.1 測定波長的選擇

齊墩果酸的最大吸收曲線見圖1,齊敦果酸標準溶液的最大吸收波長為560 nm,故選擇560 nm作為總三萜測定的波長。

圖1 齊墩果酸吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrogram of oleanolic acid

2.2 標準曲線的繪制

齊敦果酸的標準曲線見圖2,其線性回歸方程為y=0.0238x+0.05,R2=0.9999,線性關系良好。

圖2 齊敦果酸標準曲線Fig.2 Standard curve of oleanolic acid

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 不同溶劑對眼樹蓮中總三萜提取量的影響 不同溶劑對眼樹蓮中總三萜提取量的影響實驗結果見圖3,乙醇的提取量為10.54 mg/g,石油醚的提取量為7.31 mg/g,乙酸乙酯的提取量為14.92 mg/g,其中乙酸乙酯作為溶劑提取眼樹蓮中總三萜提取量最高,故選取乙酸乙酯作為提取溶劑。

圖3 不同溶劑對眼樹蓮中總三萜提取量的影響Fig.3 Effect of different solvents on the yield oftotal triterpenoids from Dischidia chinensis

2.3.2 超聲時間對眼樹蓮中總三萜提取量的影響 超聲時間對眼樹蓮中總三萜提取量的影響結果見圖4。由圖4可知,眼樹蓮中總三萜的提取量隨提取時間呈先升高后降低的趨勢。浸提時間在20～40 min之間總三萜的提取量不斷上升,在40 min時眼樹蓮總三萜的提取量達到最大,為17.44 mg/g,隨后總三萜的提取量逐漸降低。造成此現象的原因可能是剛開始時物料與溶劑的接觸越來越充分,故提取量有所增加,而后隨時間的增加溶出的雜質增多,從而阻礙了浸提效果[13,25]。由于超聲時間為50、60 min時，總三萜含量明顯降低，故眼樹蓮中總三萜適宜的超聲時間為20～40 min。

圖4 超聲時間對眼樹蓮中總三萜提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield oftotal triterpenoids from Dischidia chinensis

2.3.3 料液比對眼樹蓮中總三萜提取量的影響 不同料液比對眼樹蓮中總三萜提取量的實驗結果見圖5,由圖5可知,料液比小于1∶30 (g/mL)時,眼樹蓮中總三萜提取量隨料液比的增加而增加,料液比較低時料液粘稠,不利于超聲波空化作用,也阻礙了超聲波在溶劑中的傳播擴散[15],故隨著料液比的增加,眼樹蓮中總三萜提取量提高。當料液比超過1∶30 (g/mL)之后提取量隨料液比增加而呈下降趨勢,可能因溶劑量過多反而影響了超聲波對眼樹蓮細胞的破碎,進而影響了機械學和熱力學作用[15],從而導致眼樹蓮中總三萜提取量下降。另外從經濟角度考慮,料液比過大也會增加溶劑和能耗從而造成浪費,并增加下一步濃縮工序的難度[13,26],故選擇適宜的提取料液比為1∶10～1∶30 (g/mL)。

圖5 料液比對眼樹蓮中總三萜提取量的影響Fig.5 Effect of material liquid ratio on the yield oftotal triterpenoids from Dischidia chinensis

2.3.4 超聲功率對眼樹蓮中總三萜提取量的影響 超聲功率對眼樹蓮中三萜化合物提取量的影響實驗結果見圖6,由圖6可知,隨超聲功率的增加,眼樹蓮中總三萜的提取量呈先上升后下降的趨勢。當超聲波功率達到200 W時,總三萜的提取量到達最大值,此時是由于超聲波的空化作用與機械作用達到最佳結合點,眼樹蓮中總三萜完全溶出所致[13]。一般認為,超聲功率越大,產生的機械效應和空化效應越強烈[18]。所以,在一定超聲功率內,眼樹蓮中總三萜的擴散速度隨功率的增加也增快,進而總三萜的提取量也隨之升高。但是當超聲波功率達到一定值后,超聲介質的內外滲透壓基本相等,再提高超聲功率有效成分的滲出作用不明顯[13],這時眼樹蓮的表面可能形成一道屏障,影響總三萜浸提,所以這時超聲波功率越大反而提取量越小。故超聲功率選擇150～250 W為宜。

圖6 超聲功率對眼樹蓮中總三萜提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the yield oftotal triterpenoids from Dischidia chinensis

2.3.5 溫度對眼樹蓮中總三萜提取量的影響 不同溫度對眼樹蓮中總三萜提取量的影響實驗結果見圖7,圖7可知,隨著超聲溫度的升高,總三萜提取量逐漸增加,當溫度大于55 ℃以后提取提取量開始下降,這是由于隨著溫度的上升,物質擴散速率增加,分子運動越劇烈,有利于三萜化合物的提取[27]。但是溫度過高,會影響三萜化合物結構的穩定,一些熱敏性的三萜化合物逐漸分解,繼而導致提取量下降,故選擇適宜的提取溫度為45～55℃。

圖7 溫度對眼樹蓮中總三萜提取量的影響Fig.7 Effect of temperature on the yield oftotal triterpenoids from Dischidia chinensis

2.4 正交試驗結果

從正交優化試驗結果表3可知,經過均值和極差分析與比較,極差值R越大,說明該因素對總三萜提取量的影響越大[28],各因素對眼樹蓮中總三萜提取量影響作用的主次關系為B>D>C>A,即料液比>溫度>超聲功率>超聲時間。由表4正交試驗方差分析結果可知,料液比、溫度對眼樹蓮中總三萜提取量有較大影響,并具有顯著性差異(P<0.05),超聲提取時間、超聲功率對眼樹蓮中總三萜提取量的影響較小,無顯著差異(P>0.05)。由k值大小可知,正交試驗優化得出的工藝組合為A2B2C2D1,而正交試驗中提取提取量最高的組合為A1B3C2D1,因料液比對眼樹蓮中總三萜提取量影響最大,將兩個組合進行驗證實驗,實驗結果見表5。

表3 眼樹蓮中總三萜提取工藝正交試驗結果Table 3 Orthogonal experiment results of extractiontechnology of total triterpenoids from Dischidia chinensis

由表5驗證實驗結果可知,眼樹蓮提取總三萜提取量的最優提取工藝為A2B2C2D1,即超聲提取時間30 min,料液比1∶20 (g/mL),超聲功率200 W,超聲溫度55 ℃,平行提取3次,獲得眼樹蓮中總三萜的最高提取量為20.82 mg/g,RSD為0.16%。

表4 眼樹蓮中總三萜提取工藝方差分析結果Table 4 Analysis of variance of extraction technology oftotal triterpenoids from Dischidia chinensis

表5 驗證實驗結果(n=3)Table 5 Results of verification experiment(n=3)

2.5 眼樹蓮中總三萜清除DPPH·測定結果

實驗結果見圖8,由圖8可知,在濃度0.05～2.00 mg/mL范圍內,眼樹蓮總三萜對DPPH·清除能力隨總三萜的濃度增大而升高,當濃度達到1.00 mg/mL后,其清除率達到26.08%,之后當濃度增加至2.00 mg/mL,清除率為26.86%,增加不很明顯,并接近于平衡,其線性方程為y=10.557x+9.201,R2=0.8349。在同樣實驗條件下,VC對DPPH·清除率隨著濃度的變大迅速提高,當VC濃度達到2.00 mg/mL,清除為91.79%,曲線趨于直線,其線性方程為y=32.7x+29.321,R2=0.9748。根據SPSS軟件數據分析,眼樹蓮總三萜的IC50為3.218 mg/mL,對照品VC的IC50為0.582 mg/mL。實驗結果表明,眼樹蓮總三萜對具有一定DPPH·清除能力,但是與VC相比較,DPPH·消除能力較弱,說明其抗氧化能力不是很強。

圖8 眼樹蓮中總三萜和VC對DPPH·的清除作用Fig.8 Total triterpenoids from Dischidia chinensisand ascorbic acid on DPPH· radical

2.6 超聲提取法與其他提取法比較的實驗結果

3種提取方法提取比較實驗結果見表6,由表6可知,超聲提取的提取量明顯高于其他兩種方法。

表6 3種提取方法實驗結果的比較Table 6 Comparison of experimental resultsof three extraction methods

3 結論

在單因素實驗的基礎上,通過正交試驗設計,比較深入地研究了超聲提取時間、料液比、超聲功率和提取溫度等因素對眼樹蓮提取總三萜提取量的影響,確定了各因素參數。實驗結果表明,各因素對眼樹蓮中總三萜提取量影響作用的順序為:料液比>溫度>超聲功率>超聲時間。料液比、溫度對眼樹蓮中總三萜提取量有較大影響,并具有顯著性差異(P<0.05),超聲提取時間、超聲功率對眼樹蓮中總三萜提取量的影響較小,無顯著差異(P>0.05)。最佳提取工藝為:超聲提取時間為30 min,料液比為1∶20 (g/mL),超聲波功率為200 W,溫度為55 ℃。在該條件下,眼樹蓮總三萜的平均提取量是20.82 mg/g。該工藝提取獲得的眼樹蓮總三萜濃度為2.00 mg/mL時,對DPPH·的清除率為26.86%。將該實驗方法與傳統溶劑浸提、索氏提取進行比較,其提取量明顯高于其他兩種方法,綜合多方面考慮,采用超聲波輔助法對眼樹蓮中總三萜的提取率較高,同時該方法具有設備簡單、提取效率高、時間少、操作簡便、節約能源等優點[13],是提取眼樹蓮中總三萜的一種有效方法。